JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 6:15 min. • July 8th, 2025
Nelle cellule, le proteine si legano alle loro proteine interagenti attraverso sequenze specifiche nella loro struttura, modulando il funzionamento delle proteine intracellulari.
Per rilevare le interazioni proteiche intracellulari, prelevare una coltura cellulare aderente. Aspirare il terreno.
Aggiungere un peptide biotinilato che penetra nelle cellule, una soluzione BCPP e incubare.
Ogni BCPP contiene una sequenza peptidica che aiuta nel legame specifico con la proteina intracellulare bersaglio. Il peptide ha un peptide che penetra nelle cellule, CPP, all'estremità N del peptide e biotina all'estremità C per una facile rilevazione.
Durante l'incubazione, la regione CPP caricata positivamente facilita l'ingresso del peptide legato attraverso la membrana cellulare, raggiungendo il citoplasma. Il peptide si lega al suo partner proteico interagente intracellulare, formando un complesso proteico BCPP-bersaglio.
Aggiungere un tampone contenente molecole detergenti che rompono la membrana cellulare e rilasciano complessi proteici bersaglio BCPP e altri componenti cellulari.
Aggiungere una soluzione di avidina legata a perle di agarosio, una glicoproteina che si lega specificamente alla biotina nei BCPP. Incubare, consentendo il legame irreversibile dell'avidina alla biotina e purificando i complessi proteici avidina-BCPP-bersaglio.
Centrifugare per pellettare le perline. Risospendere le perle in un tampone per scindere i legami non covalenti tra le proteine ed eluire i complessi CPP-peptide-proteina dalle perle di biotina-avidina.
Analizzare i complessi CPP-peptide-proteina mediante western blotting. Una banda di peso molecolare più elevata per il complesso CPP-peptide-proteina rispetto ai componenti del complesso indica un'interazione riuscita tra i partner proteici interagenti.
Aggiungere il volume della soluzione madre di BCPP alle colture cellulari per raggiungere la concentrazione che si è dimostrata efficace.
Pertanto, aggiungere 92,8 microlitri di 2 milligrammi per millilitro di TAT-Connexin-43266-283-Biotina per millilitro di terreno di coltura. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti, per assicurarsi che avvengano le interazioni tra il BCPP e i suoi partner intracellulari.
Per eseguire l'estrazione delle proteine, aspirare completamente il terreno di coltura. Quindi, lavare le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato per 150 centimetri, con molta attenzione per evitare il distacco delle cellule.
Per ottenere il lisato cellulare, aggiungere 3 millilitri di tampone di lisi per pallone da 150 centimetri quadrati e raschiare accuratamente la superficie utilizzando un raschietto cellulare. Inclinando il pallone di circa 45 gradi sarà più facile raccogliere i lisati cellulari nelle provette corrispondenti.
Versare 1 millilitro di lisato cellulare per provetta in 3 provette da 1,5 millilitri contrassegnate per condizione. Per il pull-down, centrifugare le provette da 1,5 millilitri a 11.000 x g per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Trasferire i surnatanti in nuove provette etichettate A. Trasferire un'aliquota del surnatante per condizione in diverse provette etichettate B. Quindi, aggiungere 16,6 microlitri di tampone Laemmli 4x per 50 microlitri di lisato e congelare a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, omogeneizzare molto bene l'agarosio NeutrAvidin agitando delicatamente.
Tagliare le punte dei puntali delle pipette per aumentarne il diametro e migliorare il pipettaggio delle perline. Quindi, aggiungere 50 microlitri di NeutrAvidin agarosio per millilitro di lisato cellulare nelle provette A. Incubare i lisati cellulari a 4 gradi Celsius durante la notte con agitazione molto delicata per consentire a NeutrAvidin di interagire con i BCPP legati ai loro partner intracellulari.
Quindi, centrifugare a 3.000 volte g per 1 minuto al 4% di gradi Celsius per raccogliere il complesso di NeutrAvidin con le proteine. Rimuovere con cautela i surnatanti e trasferirli in tubi puliti etichettati con l'etichetta C. Conservarli per utilizzarli nel caso in cui il pull down non riesca.
Per lavare il complesso di NeutrAvidin con le proteine, aggiungere un tampone di lisi fresco ai pellet delle provette A. Risospendere il pellet per inversione e ripetere la centrifugazione. Ripeti questo lavaggio per altre cinque volte. Tutti questi surnatanti possono essere scartati.
Successivamente, aggiungere 40 microlitri di 2x tampone Laemmli per tubo da 1,5 millilitri per pellet ottenuti da 150 fiasche di centimetri quadrati di celle confluenti. Quindi, eluire a 100 gradi Celsius per 5 minuti per dissociare le interazioni tra le proteine.
Dopo l'eluizione, centrifugare per 30 secondi a 8.200 volte g per pellettare le perle di NeutrAvidin. Trasferire i surnatanti contenenti le proteine dissociate con punte capillari in nuove provette etichettate D.
Questi surnatanti sono ora pronti per essere caricati in un Western blot come descritto nel protocollo di testo, oppure possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius.