Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine

La spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza può determinare lo stato di oligomerizzazione delle proteine in un campione.

Per iniziare, prendi un vetrino da camera contenente una soluzione di monomero proteico marcato in fluorescenza. Posizionare il vetrino sotto un microscopio confocale. Focalizzare il raggio laser su una piccola parte del campione, il volume confocale, per eccitare i monomeri proteici.

Le molecole proteiche si diffondono dentro e fuori dal volume confocale a causa del moto browniano. Questo movimento provoca rapidi cambiamenti nell'intensità della fluorescenza, portando a fluttuazioni dell'intensità della fluorescenza nel tempo.

Aggiungi l'agente dimerizzante, un ligando bivalente che aiuta due monomeri proteici a legarsi e, quindi, a formare un dimero. A causa della dimerizzazione, due etichette fluorescenti si uniscono per formare una singola particella, che aumenta l'intensità della fluorescenza per particella, la luminosità molecolare.

L'aumento della luminosità molecolare dovuto alla dimerizzazione aumenta l'ampiezza delle fluttuazioni della fluorescenza, poiché due etichette fluorescenti entrano ed escono dal volume confocale.

Ottenere immagini del volume confocale nel tempo prima e dopo l'aggiunta dell'agente dimerizzante.

Calcola la luminosità dei singoli pixel nelle immagini confocali e ottieni la curva di luminosità media nel tempo.

L'aggiunta dell'agente dimerizzante si traduce in un aumento di due volte della luminosità a causa dei doppi segnali di fluorescenza da ciascuna particella, mentre il numero totale di molecole proteiche rimane lo stesso, indicando la formazione di dimeri.

Per impostare l'array di piastre multipozzetto, preparare innanzitutto una soluzione di FKBP12 purificato a 100 nanomolari nello stesso tampone utilizzato per la cromatografia ad esclusione dimensionale. Sonicare e centrifugare con una rotazione rapida di 13.000 giri/min per prevenire la formazione di aggregati.

Ora, pipettare da 100 a 200 microlitri della proteina diluita in una camera di osservazione a 8 pozzetti con fondo di vetro. Aggiungere il dimerizzatore BB alle concentrazioni finali di 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nanomolari. Come riferimento, preparare una soluzione di 100 nanomolari mVenus da solo per valutare i potenziali effetti di aggregazione e precipitazione e per recuperare un valore di luminosità per il monomero con le stesse impostazioni di acquisizione.

Può essere utilizzato qualsiasi sistema confocale per microscopio a scansione ottica dotato di rivelatori digitali o rivelatori analogici ben caratterizzati, e in grado di mantenere un tempo di permanenza costante per ogni pixel acquisito. Seleziona l'obiettivo a immersione in acqua per la correzione del collare progettato per la spettroscopia di correlazione della fluorescenza.

Aggiungere ora una goccia d'acqua all'obiettivo di immersione in acqua di correzione del collare. Montare la camera di osservazione a 8 pozzetti nel tavolino. Impostare il percorso del fascio di eccitazione accendendo il laser a 514 nanometri e impostandolo a una potenza compresa tra 20 e 100 nanowatt all'uscita dell'obiettivo. Accendere un rilevatore HyD. Sono preferibili rivelatori in grado di contare i fotoni. Selezionare la finestra di emissione da 520 a 560 nanometri.

Per la modalità di acquisizione, utilizzare 16 x 16 pixel.

Impostate il tempo di permanenza dei pixel in modo che il tempo di permanenza dei pixel sia più lungo della diffusione delle proteine e il tempo di permanenza dei pixel sia molto più breve. Ciò corrispondeva all'impostazione del tempo di permanenza a circa 13 microsecondi per il sistema utilizzato in questa dimostrazione.

Impostare il foro stenopeico su un'unità Airy per l'emissione corrispondente di circa 545 nanometri. Selezionare la modalità di acquisizione xy-time e selezionare il numero di fotogrammi da acquisire per acquisizione e bene. Ora, imposta la dimensione dei pixel a circa 120 nanometri.

Se il sistema è dotato di modalità ad alta produttività, introdurre le coordinate di ciascun pozzo e il numero di acquisizioni per pozzo per automatizzare il processo. Se il sistema è dotato di un sistema di perfusione, caricare la soluzione BB e programmare la perfusione in modo che inizi subito dopo il 5.000° fotogramma per valutare la cinetica della dimerizzazione durante l'acquisizione di 10.000 immagini.

Seleziona il pozzo corretto e concentrati sulla soluzione. Quindi, avvia l'acquisizione e salva la pila di immagini risultante in formato TIFF.