Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Nella sua forma attiva, il monomero Ras associato alla membrana plasmatica – una proteina legante i nucleotidi guanina – recluta Raf, una proteina chinasi inattiva che si lega a Ras attraverso il suo dominio legante Ras.

Questo legame si traduce in un complesso Ras-Raf funzionale che innesca il processo di segnalazione a valle.

Per visualizzare l'interazione intracellulare Ras-Raf, iniziare con una sospensione di cellule geneticamente modificate in un vetrino ben camerato. Queste cellule esprimono due proteine di fusione non fluorescenti: una comprende Ras legata a metà di un fluoroforo fotoattivabile tramite il suo N-terminale, e l'altra è Raf fusa all'altra metà dello stesso fluoroforo al suo C-terminale.

All'interno delle cellule, le proteine di fusione contenenti Ras si agganciano alla membrana plasmatica e interagiscono con le proteine di fusione contenenti Raf, ricostituendo i frammenti della proteina fluorescente in un fluoroforo fotoattivabile completo. L'assenza di legatura Ras e Raf mantiene separate le due metà del fluoroforo.

Aggiungere un reagente fissativo al vetrino. Le molecole fissative formano legami incrociati con le proteine e stabilizzano i complessi proteici.