Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Nella sua forma attiva, il monomero Ras associato alla membrana plasmatica – una proteina legante i nucleotidi guanina – recluta Raf, una proteina chinasi inattiva che si lega a Ras attraverso il suo dominio legante Ras.

Questo legame si traduce in un complesso Ras-Raf funzionale che innesca il processo di segnalazione a valle.

Per visualizzare l'interazione intracellulare Ras-Raf, iniziare con una sospensione di cellule geneticamente modificate in un vetrino ben camerato. Queste cellule esprimono due proteine di fusione non fluorescenti: una comprende Ras legata a metà di un fluoroforo fotoattivabile tramite il suo N-terminale, e l'altra è Raf fusa all'altra metà dello stesso fluoroforo al suo C-terminale.

All'interno delle cellule, le proteine di fusione contenenti Ras si agganciano alla membrana plasmatica e interagiscono con le proteine di fusione contenenti Raf, ricostituendo i frammenti della proteina fluorescente in un fluoroforo fotoattivabile completo. L'assenza di legatura Ras e Raf mantiene separate le due metà del fluoroforo.

Aggiungere un reagente fissativo al vetrino. Le molecole fissative formano legami incrociati con le proteine e stabilizzano i complessi proteici.

Rimuovere il reagente fissativo e aggiungere un tampone di imaging. Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza per microscopia a localizzazione fotoattivata, PALM. Illuminare le cellule con un laser ad alta intensità, attivando un piccolo sottoinsieme di molecole fluorescenti.

Immagina la fluorescenza di origine casuale prodotta da ciascun complesso Ras-Raf di dimensioni nanometriche, marcato con fluoroforo, visibile come punti di fluorescenza ad alta risoluzione.

Per preparare un campione per l'imaging, piastra circa 5,5 x 10⁴ cellule di espressione stabili per pozzetto di un vetrino a camera a 8 pozzetti con fondo di vetro, in 350 microlitri di DMEM privo di rosso fenolo. Utilizzare paraformaldeide fresca con glutaraldeide per fissare le cellule e, dopo aver sostituito il fissativo con PBS o tampone di imaging, vorticare particelle d'oro a 100 nanometri e aggiungere 35 microlitri per pozzetto per tracciare la deriva dello stadio durante l'imaging.

Avvicinati al microscopio e accendi i laser a 405 e 561 nanometri. Tenendo le persiane chiuse a questo punto, assicurarsi che lo specchio dicroico a 561 nanometri e il filtro notch siano in posizione. Aprire il software di acquisizione delle immagini.

Accendere la fotocamera EMCCD e lasciarla raffreddare, quindi impostare il tempo di esposizione su 100 millisecondi e il guadagno EMCCD su un valore appropriato. Aggiungere olio da immersione all'obiettivo e fissare il campione sul tavolino del microscopio. Successivamente, con il campo chiaro o con il laser a 561 nanometri, metti a fuoco il campione.

Per l'imaging di Ras e di altre proteine di membrana, utilizzare un obiettivo TIRF apocromatico 60X con un'apertura numerica di 1,49 e portare il microscopio in configurazione TIRF.

Regolare il laser di eccitazione in modo che sia decentrato quando si colpisce l'apertura posteriore dell'obiettivo TIRF, il che causerà la flessione del laser quando raggiunge l'interfaccia del buffer del vetrino. Continuare a regolare la posizione di incidenza del laser fino a quando non viene raggiunto l'angolo critico e il laser viene riflesso indietro.

Cerca una cella da visualizzare con diverse particelle d'oro in vista. Quindi, imposta una regione di interesse che racchiuda la cellula o una regione di essa e le particelle d'oro.

Nel caso in cui si stia già verificando un'attivazione sufficiente a causa degli alti livelli di espressione, iniziare l'acquisizione con il laser a 405 nanometri spento e il laser a 561 acceso. In caso contrario, accendere il laser a 405 nanometri alla potenza di fabbrica più bassa e aumentarlo gradualmente fino a quando non ci sono decine di molecole per fotogramma o in modo che le singole molecole siano ben separate.

Man mano che l'acquisizione dei dati continua, aumentare gradualmente la potenza del laser a 405 nanometri per mantenere la densità dello spot approssimativamente costante. Continuare l'acquisizione dell'immagine fino a quando l'elevata potenza 405 non avvia altri eventi di attivazione.