Saggio ibrido lievito-uno modificato per rilevare le interazioni eteromeriche tra complesso proteico e DNA

Per rilevare le interazioni tra complessi proteici eteromerici che coinvolgono più proteine con DNA bersaglio utilizzando il saggio di lievito modificato one-hybrid, prelevare una piastra multipozzetto contenente la concentrazione desiderata di una coltura cellulare di lievito trasformata e in crescita attiva.

Queste cellule contengono una specifica sequenza di DNA a monte del gene reporter β-galattosidasi-codificante, guidata dal promotore GAL-4, mentre mancano della proteina endogena del fattore di trascrizione GAL-4. Le cellule esprimono una proteina bersaglio fusa al dominio di attivazione GAL-4 e un'altra proteina priva del dominio di legame al DNA GAL-4.

Se queste proteine interagiscono, potrebbero formare un complesso, consentendo alla proteina bersaglio di legarsi alla sequenza di DNA a monte nella regione del promotore del gene reporter. Il dominio di attivazione GAL-4 attiva l'espressione dell'enzima reporter β-galattosidasi.

centrifuga. Risospendere le celle in un tampone adatto. Congelare-scongelare le cellule per lisarle e rilasciare β-galattosidasi. Aggiungere beta-mercaptoetanolo e un tampone contenente substrato β-galattosidasi.

Il beta-mercaptoetanolo stabilizza l'