JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:12 min • July 8th, 2025
Per rilevare le interazioni tra complessi proteici eteromerici che coinvolgono più proteine con DNA bersaglio utilizzando il saggio di lievito modificato one-hybrid, prelevare una piastra multipozzetto contenente la concentrazione desiderata di una coltura cellulare di lievito trasformata e in crescita attiva.
Queste cellule contengono una specifica sequenza di DNA a monte del gene reporter β-galattosidasi-codificante, guidata dal promotore GAL-4, mentre mancano della proteina endogena del fattore di trascrizione GAL-4. Le cellule esprimono una proteina bersaglio fusa al dominio di attivazione GAL-4 e un'altra proteina priva del dominio di legame al DNA GAL-4.
Se queste proteine interagiscono, potrebbero formare un complesso, consentendo alla proteina bersaglio di legarsi alla sequenza di DNA a monte nella regione del promotore del gene reporter. Il dominio di attivazione GAL-4 attiva l'espressione dell'enzima reporter β-galattosidasi.
centrifuga. Risospendere le celle in un tampone adatto. Congelare-scongelare le cellule per lisarle e rilasciare β-galattosidasi. Aggiungere beta-mercaptoetanolo e un tampone contenente substrato β-galattosidasi.
Il beta-mercaptoetanolo stabilizza l'enzima β-galattosidasi. La β-galattosidasi idrolizza il substrato della β-galattosidasi, formando un cromogeno giallo.
Aggiungere una soluzione di carbonato di sodio per denaturare la β-galattosidasi e fermare la reazione. Centrifuga. Trasferire il surnatante contenente cromogeno giallo in una piastra a più pozzetti. Utilizzando un lettore di piastre, misurare la densità ottica della soluzione a una lunghezza d'onda adeguata per calcolare l'attività della β-galattosidasi.
Una maggiore attività della β-galattosidasi indica interazioni positive tra le proteine e la sequenza di DNA bersaglio, che porta all'espressione della β-galattosidasi.
Risospendere la coltura e trasferire 125 microlitri da ciascun pozzetto a una piastra spettrofotometrica. Misurare la densità ottica a 600 nanometri per assicurarsi che sia compresa tra 0,3 e 0,6. Centrifugare le celle rimanenti nel blocco del pozzetto profondo a 3.000 volte g e 21 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il surnatante invertendolo.
Aggiungere 200 microlitri di tampone Z a ciascun pozzetto e vortice. Centrifugare a 3.000 volte g e 21 gradi Celsius per 5 minuti. Rimuovere il surnatante invertendolo. Aggiungere 20 microlitri di tampone Z a ciascun pozzetto e vortice. Coprire la piastra con una pellicola sigillante resistente ai cicli di gelo-scongelamento.
In una cappa aspirante, eseguire quattro cicli di congelamento-scongelamento utilizzando azoto liquido in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di soluzione Z-buffer/beta-mercaptoetanolo/ONPG appena preparata in ogni pozzetto. Incubare a 30 gradi Celsius per 17-24 ore o fino a quando non si sviluppa il colore. Controlla che il colore si sia sviluppato.
Aggiungere 110 microlitri di carbonato di sodio 1 molare in ogni pozzetto per fermare la reazione. Registra l'ora e agita la piastra. Centrifugare a 3.000 volte g e 21 gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 125 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto a una piastra spettrofotometrica. Misura la densità ottica a 420 nanometri.