Saggio di legame in vitro basato su SELEX per identificare le interazioni RNA-proteina

L'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale, SELEX, consente l'identificazione di sequenze di RNA leganti le proteine.

In primo luogo, ottenere un pool di RNA randomizzato contenente RNA radiomarcati con sequenze randomizzate che si ripiegano in strutture altamente specifiche. Incubare con la proteina bersaglio. La proteina si lega alle molecole di RNA con sequenze specifiche e strutture tridimensionali, mentre gli RNA non specifici rimangono non legati.

Passare il composto attraverso un filtro nitrocellulosico. L'RNA non legato passa attraverso i pori del filtro, mentre i complessi RNA-proteina rimangono trattenuti.

Tagliare il filtro contenente il complesso RNA-proteina in frammenti. Ripetere l'interazione RNA-proteina incubando il pool di RNA con una concentrazione ridotta della proteina bersaglio, consentendo solo il legame della sequenza ad alta affinità, mentre le sequenze a bassa affinità non riescono a legarsi.

Caricare questa miscela su un gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi. I complessi RNA-proteina migrano lentamente attraverso il gel rispetto agli RNA non legati a bassa affinità. L'imaging su gel a raggi X mostra uno spostamento di banda corrispondente alla posizione del complesso RNA-proteina.

Affettare la porzione di gel contenente il complesso. Aggiungere la proteinasi K ai frammenti del filtro e alle fette di gel, digerendo le proteine e rilasciando l'RNA dal complesso. Aggiungere fenolo-cloroformio e centrifugare, separando l'RNA dalle proteine digerite.

Mescolare il surnatante contenente RNA con acetato di sodio ed etanolo. Centrifuga per precipitare l'RNA. Risospendere in acqua priva di RNasi. Trascrivere l'RNA in DNA complementare e amplificare il DNA con PCR.

Ripetere diversi cicli di separazione a base di filtro e a base di gel per ottenere un pool di sequenze di DNA specifiche per la proteina bersaglio.

Per legare la proteina e l'RNA in un volume di reazione di 100 microlitri, preparare prima 10 millimolari di tris-cloridrato a pH 7,5, contenente 50 millimolari di cloruro di potassio, un millimolare di DTT, 0,09 microgrammi per microlitro di albumina sierica bovina, 0,5 unità per microlitro di RNAsina, 0,15 microgrammi per microlitro di tRNA e 1 millimolare di EDTA. Quindi, aggiungere 30 microlitri di proteina ricombinante PTB e 10 microlitri di RNA dal pool appropriato.

Posizionare le provette contenenti le reazioni di legame in un blocco di temperatura per circa 30 minuti a 25 gradi Celsius. Successivamente, frazionare l'RNA legato dall'RNA non legato attraverso quattro cicli di selezione e amplificazione. Innanzitutto, filtrare il campione da 100 microlitri a temperatura ambiente attraverso un filtro in nitrocellulosa collegato a un collettore a vuoto. Il complesso RNA-proteina rimane sul filtro.

Con una lama di rasoio sterile, tagliare il filtro in frammenti e inserirli in una provetta da centrifuga. Immergere i pezzi del filtro nel tampone proteinasi K e posizionarlo su un bicchiere per un minimo di tre ore o durante la notte per recuperare l'RNA.

Per deproteinizzare il campione di RNA, aggiungere un volume uguale di fenolo-cloroformio, vortex. E poi centrifugare ad alta velocità per cinque minuti a temperatura ambiente. Ottenere la fase acquosa ed estrarre nuovamente con cloroformio. Successivamente, miscelare il surnatante con 1/10 del volume di acetato di sodio a 3 molari a pH 5,2 e due o tre volumi di etanolo assoluto.

Lasciare la provetta in un congelatore a -80 gradi Celsius per 30 minuti, quindi centrifugarla ad alta velocità per 10 minuti. Ripetere le fasi di lavaggio e asciugatura con etanolo al 70% e solubilizzare l'RNA in acqua trattata con DEPC. Dopo il primo ciclo di saggio di legame con il filtro, eseguire altri tre cicli.

Successivamente, eseguire due cicli di trascrizione, legame e amplificazione per separare le frazioni di RNA legate alle proteine dalle frazioni non legate. Pre-fondere un gel nativo di poliacrilammide al 5% con un rapporto di 60 a 1 di acrilammide bisacrilammide in tampone TBE 0,5x. Quindi, impostare la reazione di legame RNA-proteina.

Posizionare il gel in un dispositivo di elettroforesi riempito con tampone TBE 0,5x in una cella frigorifera a 4 gradi Celsius. Applicare 250 volt per 15 minuti e pipettare la reazione di legame in diversi pozzetti. Quindi, inoltre, frazionare l'RNA legato dall'RNA non legato eseguendo l'elettroforesi a 250 volt per una o due ore.

Successivamente, esporre il gel a una pellicola a raggi X e identificare la posizione dell'RNA legato utilizzando l'autoradiografia. Ritagliare la fetta di gel con l'RNA legato e inserirla in una provetta. Frantumare la fetta di gel e incubare nel tampone proteinasi K per tre ore o durante la notte. Ripetere l'estrazione con fenolo-cloroformio e cloroformio, come descritto in precedenza. Sintetizzare il cDNA dall'RNA disciolto.

Preparare 20 microlitri di reazione, di cui due microlitri di tampone RT 10x, due microlitri di trascrittasi inversa AMV, 1 microlitro di primer inverso, 5 microlitri di acqua e 10 microlitri di RNA disciolto. Incubare a 42 gradi Celsius per 60 minuti.

Amplificare il cDNA utilizzando da 20 a 25 cicli di PCR come descritto in precedenza. Ripetere il processo di sintesi dell'RNA, di legame con le proteine e di separazione delle frazioni legate alle proteine e non legate.