Sonda di forza biomembrana per quantificare le interazioni recettore-ligando

L'interazione tra un recettore delle cellule T, TCR, e un peptide antigenico presentato dall'MHC, o complesso maggiore di istocompatibilità, su una cellula presentante l'antigene, APC, fa sì che la cellula T eserciti una forza meccanica sull'APC. Questo fenomeno è necessario per l'attivazione delle cellule T.

Per quantificare le interazioni recettore-ligando utilizzando una sonda di forza a biomembrana, BFP, iniziare con una camera cellulare personalizzata basata su vetrino. Posizionare la camera cellulare al microscopio.

Iniettare nella camera sospensioni di globuli rossi rigonfi biotinilati, perle di vetro della sonda rivestite con complessi MHC-streptavidina-biotina legati a peptidi e cellule T. Posizionare la sonda, il target e le micropipette riempite di tampone ausiliario intorno alla camera.

Aspirare un globuli rossi biotinilato con la pipetta della sonda, posizionandolo in un'area vuota. Aspirare una cellula T con la micropipetta target, posizionandola sulla destra dei globuli rossi. Aspirare un cordone sonda con la micropipetta helper e collegarlo all'apice del globuli rossi. La streptavidina della perlina si lega alla biotina dei globuli rossi e forma una sonda di forza.

Allineare la cellula T con la sonda di forza per consentire al TCR di interagire con il suo ligando – il peptide legato all'MHC – e alla cellula T di esercitare forza sui globuli rossi. Ritrarre la cellula T per rompere il legame TCR-peptide, che deforma i globuli rossi e sposta la perlina.

Misura la forza necessaria per rompere il legame: un legame più forte richiede una forza maggiore e più tempo per rompersi, indicando una durata maggiore.

Per iniziare l'esperimento BFP, accendi il microscopio e la fonte di luce. Posizionare la camera sul tavolino principale del microscopio. Il passo successivo consiste nell'installare tutte e tre le micropipette del BFP. La sonda a sinistra serve per afferrare un RBC. L'obiettivo a destra è quello di afferrare la cella, e l'aiutante in basso a destra serve per afferrare una perlina.

Per l'installazione, utilizzare un microiniettore per riempire una micropipetta con tampone sperimentale. Estrarre la micropipetta dal supporto della pipetta e tenerla in un punto più basso per consentire al liquido di gocciolare dal puntale. Inserire rapidamente la micropipetta nel puntale di supporto, assicurandosi che nessuna microbolla d'aria penetri nella micropipetta durante l'inserimento.

Serrare la vite del supporto, quindi montare ciascun supporto per pipette sul micromanipolatore corrispondente. Spingere la micropipetta verso la camera in modo che i puntali entrino nell'area del tampone della camera. Regolare la posizione della micropipetta e trovarla sotto il campo visivo del microscopio.

Muoviti nel livello del portacamera per trovare le colonie dei tre elementi una per una. Regolare la posizione della micropipetta corrispondente ruotando le manopole dei manipolatori per consentire alla punta della micropipetta di avvicinarsi a una cellula o a un microsfone. Aspirare la cellula o il micrometallo regolando la pressione all'interno della micropipetta corrispondente. Tutte e tre le micropipette cattureranno gli elementi corrispondenti.

Muoviti all'interno dello stadio portacamera per trovare uno spazio aperto lontano dalle colonie degli elementi iniettati dove verrà eseguito l'esperimento.

Cambia la modalità visiva del microscopio per visualizzare l'immagine sul programma del computer. Spostare tutti e tre gli elementi sui puntali delle pipette nel campo visivo del programma. Quindi, allineare il tallone della sonda e l'RBC e manovrare con cautela il tallone della sonda all'apice dell'RBC. Ora, urtare brevemente il tallone sull'RBC e ritrarlo delicatamente.

Regolare la pressione della micropipetta ausiliaria per soffiare via delicatamente il cordone in modo che rimanga incollato all'apice dei globuli rossi. Allontanare la micropipetta ausiliaria, allineare il bersaglio e il cordone della sonda.

Nel programma, nella finestra Campo visivo, utilizzare gli strumenti del programma per misurare i rispettivi raggi della micropipetta della sonda, l'RBC e l'area di contatto circolare tra l'RBC e il cordone della sonda. Questi valori consentono di stimare la costante elastica dell'RBC mediante l'equazione elencata nel protocollo di testo.

Dopo aver inserito la costante elastica RBC desiderata nel programma, tracciare una linea orizzontale attraverso l'apice RBC che produrrà una curva nella finestra adiacente che indica la luminosità di ciascun pixel lungo questa linea. Trascina la linea di soglia in modo che si trovi a circa la metà della profondità della curva.

Quindi, seleziona la modalità di esperimento desiderata. Impostare i parametri come desiderato. Fare clic su Avvia per consentire al programma di spostare la pipetta target e guidare il target dentro e fuori dal contatto con la sonda.

Verrà eseguita in parallelo la raccolta dei dati che registra la posizione del cordone della sonda in tempo reale. Arresta il programma cliccando sul pulsante Interrompi esperimento, momento in cui si aprirà una finestra per consentire il salvataggio dei dati acquisiti.