Microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento di actina e microtubuli

I monomeri di actina polimerizzano in modo dalla testa alla coda per formare fibre sottili, chiamate microfilamenti. Allo stesso modo, i dimeri di tubulina polimerizzano in microtubuli cilindrici cavi più lunghi. Questi componenti del citoscheletro mantengono la forma cellulare e facilitano la motilità cellulare.

Per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento actina-microtubuli mediante microscopia a riflessione interna totale, TIRF, eseguire un assemblaggio di imaging personalizzato.

Il gruppo di imaging è costituito da due vetrini coprioggetti: un vetrino coprioggetti rivestito di silano m-PEG superiore e un vetrino coprioggetti rivestito di silano biotina-PEG inferiore. I due vetrini coprioggetti sono distanziati longitudinalmente con nastro biadesivo e sigillati ad entrambe le estremità per creare un canale di flusso.

Pipettare BSA nel canale di flusso per adescare la camera. Aggiungere la soluzione di streptavidina e incubare. Le molecole di streptavidina si legano alle molecole di biotina attaccate al PEG-silano del vetrino coprioggetti inferiore.

Fluire il buffer TIRF nel canale. Aggiungere una soluzione di miscela di citoscheletro contenente dimeri di tubulina non marcati e marcati con fluoroforo verde, insieme a monomeri di actina non marcati, marcati con biotina e marcati con fluoroforo viola.

Successivamente, aggiungere una soluzione di reazione contenente ATP (agente che promuove la polimerizzazione dell'actina) e GTP (agente che promuove la polimerizzazione della tubulina) e la proteina di accoppiamento actina-microtubuli. Incubare.

I dimeri di tubulina si legano alle molecole di GTP e polimerizzano, mentre i monomeri di actina si legano alle molecole di ATP e polimerizzano per formare rispettivamente microtubuli e microfilamenti.

Posizionare il gruppo di imaging sotto un microscopio TIRF. Eccitare i fluorofori con laser di lunghezze d'onda appropriate.

La luce di eccitazione si riflette internamente e crea un campo luminoso che illumina selettivamente i fluorofori in una regione limitata vicino all'interfaccia vetro-acqua, dove sono presenti due mezzi con diversi indici di rifrazione. In questa regione, i microfilamenti appaiono viola e i microtubuli appaiono verdi.

Tagliare 12 strisce di nastro biadesivo con retro biadesivo, fino a una lunghezza di 24 millimetri. Rimuovere un lato del supporto del nastro e fissare pezzi di nastro adiacenti alle sei scanalature presenti su una camera di imaging pulita. Rimuovere il secondo pezzo di supporto del nastro, per esporre il lato adesivo del nastro lungo ciascuna scanalatura della camera, e posizionare la camera, con il nastro rivolto verso l'alto, su una superficie pulita.

Mescolare la resina epossidica e le soluzioni indurenti, uno a uno in una piccola pesa, e utilizzare una punta P1000 per posizionare una goccia di resina epossidica mista tra le strisce di nastro all'estremità di ciascuna scanalatura della camera di imaging. Quindi, posizionare il nastro da camera, o con la resina epossidica rivolta verso l'alto, su una superficie pulita.

Rimuovere un vetrino coprioggetti rivestito dall'incubatrice a 70 gradi Celsius e sciacquare sei volte le superfici rivestite e non rivestite dei vetrini coprioggetti con acqua distillata a doppia distillazione. Asciugare con azoto gassoso filtrato, quindi applicare alla camera di imaging, con il lato del rivestimento del vetrino coprioggetti rivolto verso il nastro.

Utilizzare un puntale per pipetta P200 o P1000 per applicare pressione sull'interfaccia nastro-vetro, per garantire una buona tenuta tra il nastro e il vetrino coprioggetti. Incubare le camere assemblate a temperatura ambiente per almeno cinque-10 minuti, per consentire alla resina epossidica di sigillare completamente le pareti della camera prima dell'uso.

Le camere di perfusione scadono entro 12-18 ore dal montaggio. Utilizzare una pompa di perfusione e scambiare in sequenza le soluzioni di condizionamento nella camera di perfusione facendo scorrere 50 microlitri di BSA all'1% per adescare la camera di imaging.

Rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio del raccordo Luer-lock. Quindi, far fluire 50 microlitri di streptavidina da 0,005 milligrammi per millilitro e incubare per uno o due minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio.

Far scorrere 50 microlitri di BSA all'1% per bloccare il legame aspecifico e incubare per 10-30 secondi. Rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio. Successivamente, far scorrere 50 microlitri di tampone TIRF caldo 1x, quindi 50 microlitri di semi di microtubuli stabilizzati e biotinilati al 50%, diluiti in 1x tampone TIRF.

Impostare il tavolino o il riscaldatore dell'obiettivo in modo che mantenga una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius per 30 minuti, prima di eseguire l'imaging della prima reazione biochimica. Quindi, impostare l'intervallo di acquisizione su ogni cinque secondi, per 15-20 minuti. Quindi, impostare le esposizioni laser 488 e 647 da 50 a 100 millisecondi al 5%-10% di potenza, regolando prima la reazione di polimerizzazione per avviare l'assemblaggio del filamento di actina.

Acquisire le immagini a 647 nanometri ed effettuare le regolazioni appropriate. Quindi, regolare la reazione di polimerizzazione in un secondo pozzetto di perfusione condizionato, per avviare l'assemblaggio dei microtubuli. Visualizza a 488 nanometri e apporta le regolazioni appropriate.

Combinare tre microlitri di 488-tubulina 10-micromolare con l'aliquota da 7,2 microlitri di 100 micromolari di tubulina fluorescente non marcata, non più di 15 minuti prima dell'uso. Quindi, combinare tre microlitri di actina biotinilata diluita in volumi appropriati di actina fluorescente non marcata ed etichettata, in modo tale che la miscela finale sarà di 12,5 micromolari di actina totale, con un'etichetta fluorescente dal 10% al 30%.

Preparare la miscela di citoscheletro combinando due microlitri della miscela madre di actina da 12,5 micromolari con la miscela madre di tubulina, non più di 15 minuti prima dell'imaging. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.

Preparare la miscela di reazione proteica combinando tutti gli altri componenti sperimentali e proteine, tra cui 2x tampone TIRF, anti-candeggina, nucleotidi, tamponi e proteine accessorie. Incubare separatamente la miscela di citoscheletro nella miscela di reazione proteica, a 37 gradi Celsius per 30-60 secondi.

Per avviare la reazione, aggiungere il contenuto della miscela di reazione proteica alla miscela di citoscheletro e mescolarla. Far fluire 50 microlitri della miscela di reazione contenente 1x tampone TIRF integrato con 15 micromolari di tubulina libera, un millimolare di GTP, 0,5 micromolari di actina monomeri e volumi appropriati di controlli tampone nella camera di perfusione.

Registra un filmato time-lapse utilizzando il software del microscopio, da acquisire ogni cinque secondi, per 15-20 minuti. Condizionare bene una nuova perfusione e sostituire il volume del tampone con la proteina regolatrice di interesse e i controlli tampone. Acquisire per valutare le proteine regolatrici per le funzioni emergenti dei microtubuli di actina.