Microscopia a foglio di luce reticolare per visualizzare le interazioni recettore-ligando nelle cellule vive

La microscopia a foglio di luce su reticolo, LLSM, consente la visualizzazione delle interazioni cellula-recettore-ligando in cellule vive con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Prelevare un vetrino coprioggetti contenente cellule che esprimono il ligando trasdotto che emettono fluorescenza rossa. Fissare il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso l'alto su un portacampioni ingrassato. Fissare il supporto sul piezo di un tavolino per microscopio per consentire il posizionamento e la scansione precisi del campione durante l'imaging. Regolare le impostazioni del software per concentrarsi su una singola cellula che esprime il ligando.

Pipettare la sospensione cellulare che esprime il recettore sul vetrino coprioggetti. I recettori sono marcati con anticorpi verdi marcati con fluoroforo. Immagina le coppie di celle interagenti.

Il laser di eccitazione del microscopio emette un raggio laser circolare a polarizzazione lineare che passa attraverso lenti cilindriche per creare un foglio di luce. Il foglio di luce viene proiettato su un modulatore che rimuove la diffrazione in eccesso e la trasforma in un reticolo ultrasottile.

Il foglio di luce a reticolo illumina una sezione ultrasottile della coppia di celle interagenti e la fluorescenza emessa dalle celle interagenti viene catturata perpendicolarmente al raggio incidente. Acquisisci immagini della coppia di celle interagenti su più piani Z e acquisisci immagini bidimensionali in ciascun piano focale con una fotocamera ad alta velocità.

Utilizzando un software adatto, combinare queste immagini per formare uno z-stack, un'immagine quadridimensionale ad alta risoluzione che dimostra le dinamiche spaziotemporali dell'interazione recettore-ligando sulla superficie cellulare.

Aggiungere 10 millilitri di acqua e 30 microlitri di fluoresceina al bagno LLSM. Innanzitutto, premere Immagine (Home) per spostare l'oggetto nella posizione dell'immagine e osservare il modello di raggio laser di un singolo recipiente.

Allineare il raggio laser utilizzando la guida e la regione di interesse preimpostata per rendere il raggio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni. Il raggio dovrebbe apparire focalizzato anche nella fotocamera del cercatore. Utilizzare i due regolatori di inclinazione dello specchio, il micrometro di messa a fuoco superiore e il colore dell'obiettivo per regolare il raggio.

Successivamente, lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 millilitri di acqua per rimuovere completamente l'eventuale fluoresceina.

Per visualizzare le perline fluorescenti standard, attivare Dithering impostando su 3 nella casella 'X Galvo Range' e premere Live per visualizzare il campo corrente. Regolare manualmente lo specchio di inclinazione, il colore dell'obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per ottenere i valori di grigio più elevati. Quindi, regolare se necessario per ottenere modelli appropriati per le modalità di scansione dell'obiettivo, Z galvo, obiettivo Z plus e acquisizione della scansione del campione. Successivamente, premere Esegui in modalità di scansione del campione per raccogliere la funzione di diffusione del punto di campionamento per la de-inclinazione e la de-convoluzione. Cambia i laser in modalità a tre colori e premi di nuovo Esegui.

Per iniziare, aggiungi 100.000 cellule presentanti l'antigene al vetrino coprioggetti circolare preparato di 5 millimetri di diametro e lasciale riposare per 10 minuti. Ingrassare il portacampioni e aggiungere il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso l'alto.

Quindi, aggiungere una goccia di supporto di imaging sul retro del vetrino coprioggetti. Avvitare il supporto del campione sul piezo e premere Image (Home). Trova una cellula presentante l'antigene da visualizzare e assicurati che l'LLSM e il software di imaging funzionino correttamente.

Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostati lungo Z per trovare il vetrino coprioggetti e le celle. Trova il centro di una cellula che presenta l'antigene muovendoti nella direzione Z, quindi premi Stop per mettere in pausa il laser. Controllare il 3D e inserire le impostazioni desiderate. Premere Invio, quindi premere Esegui per raccogliere i dati.

Abbassare il tavolino in posizione di carico e aggiungere 50 microlitri di cellule T nei terreni di imaging a goccia, direttamente sopra il vetrino coprioggetti. È meglio lasciare che si formi una goccia all'estremità del puntale della pipetta e poi toccare il puntale con il liquido del bagno. Solleva lo stage facendo clic su Immagine (Invio).

Inizia l'imaging. Assicurati di impostare lo Z-stack desiderato e la lunghezza del timelapse. Ad esempio, è possibile creare un'immagine di 60 Z-stack con una dimensione del passo di 0,4 micrometri e inserire 500 fotogrammi di tempo. Interrompere la registrazione prima che vengano raggiunti i 500 fotogrammi per evitare il fotosbiancamento. Utilizzare la modalità Live per cercare coppie di celle e, quando sono state inserite le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere i dati.