Microscopia in campo scuro per visualizzare la dinamica diffusionale di nanorod sulla membrana cellulare

Per studiare la dinamica diffusionale dei nanorod d'oro su una membrana cellulare viva utilizzando la microscopia in campo oscuro, la DFM, combinata con il tracciamento di singole particelle, inizia con un vetrino coprioggetti sterilizzato in una piastra di coltura contenente un terreno adatto. Aggiungere la sospensione cellulare sul vetrino coprioggetti. Il terreno facilita la crescita cellulare.

Incubare con nanobarre d'oro caricate positivamente che si adsorbono sulla membrana cellulare caricata negativamente tramite interazioni elettrostatiche. Pipettare il terreno dal piatto alla scanalatura di un vetrino. Posizionare il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso il basso sulla scanalatura e sigillare.

Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio in campo scuro. Il microscopio illumina il campione con una luce obliqua ad alto angolo che passa attraverso un condensatore specializzato in campo scuro.

Dopo l'illuminazione delle nanobarre, gli elettroni liberi sulla superficie delle nanobarre oscillano a una frequenza risonante con la luce incidente. Gli elettroni oscillanti diffondono la luce a una lunghezza d'onda specifica catturata dalla lente dell'obiettivo, consentendo la visualizzazione dei nanorod.

Allo stesso modo, la membrana cellulare, composta da lipidi e proteine, disperde la luce incidente con un indice di rifrazione più elevato rispetto al mezzo circostante, creando un'immagine luminosa su uno sfondo scuro. Cattura immagini DFM di serie temporali.

Utilizzando un software adatto, eseguire l'analisi di tracciamento di singole particelle sulle immagini DFM per visualizzare la diffusione dei nanorod attraverso la membrana cellulare con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Inizia bruciando un vetrino coprioggetti di vetro imbevuto di etanolo sulla fiamma e posizionando il vetrino coprioggetti in una piastra di coltura cellulare di 35 x 10 millimetri contenente 2 millilitri di terreno di coltura cellulare senza rosso fenolo. Aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare di interesse sul vetrino coprioggetti e agitare delicatamente il piatto avanti e indietro e a sinistra e a destra per distribuire uniformemente le cellule.

Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per circa 12 ore fino a quando le cellule raggiungono una confluenza dal 20% al 40% prima di aggiungere 20 microlitri di nanobarre d'oro rivestite di CTAB alla capsula. Dopo aver agitato delicatamente per disperdere uniformemente le nanobarre sul piatto, posizionare il piatto in un'atmosfera umidificata per 5 minuti.

Al termine dell'incubazione, trasferire lentamente 100 microlitri di surnatante dalla capsula nella scanalatura di un vetrino e posizionare con cura il vetrino coprioggetti con il lato rivolto verso il basso sulla scanalatura del vetrino. Quindi, sigillare il bordo del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie e lasciare asciugare lo smalto prima di posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio a campo scuro.

Per l'inseguimento di singole particelle mediante microscopia in campo scuro, posizionare una goccia di olio sul condensatore in campo scuro immerso in olio e ruotare la manopola finché il condensatore non tocca il vetrino. Posizionare una goccia d'olio sulla parte superiore del vetro di copertura e ruotare la manopola di messa a fuoco fino a quando l'obiettivo a immersione in olio 60x tocca l'olio.

Accendere la sorgente luminosa e ruotare leggermente la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco il piano di imaging. Quindi, fare clic sull'icona della fotocamera nel software del microscopio per registrare una serie temporale di immagini di dispersione della luce di campioni utilizzando la fotocamera CMOS a colori e salvare l'immagine in formato TIFF.

Per estrarre una singola traiettoria a lungo termine, aprire l'immagine in ImageJ e fare clic su Immagine | Digita | e 8 bit per convertire l'immagine dalla modalità RGB alla modalità a 8 bit. Per regolare il contrasto, fare clic su Immagine | Regola | Luminosità | Contrasto e impostare i parametri. Seleziona una particella target e usa "Ctrl + X" per tagliare lo sfondo della serie temporale.

Fare clic su Plug-in | Tracciatore particelle classico | e Tracciatore particelle per aprire la finestra di rilevamento e collegamento particelle e impostare il raggio su 6, il taglio su 0 e il percentile su 0,01%. Imposta l'intervallo di collegamento su 10 e lo spostamento su 10, quindi fai clic su "OK" per aprire la finestra dei risultati del tracker di particelle e vedere i risultati.

Fare clic su "Visualizza tutte le traiettorie" per ispezionare le traiettorie generate. Se la traiettoria generata dal software e la traiettoria in movimento delle nanobarre d'oro corrispondono, fai clic su "Salva rapporto completo" per salvare i risultati. Se la traiettoria generata dal software non corrisponde alla traiettoria in movimento delle nanobarre d'oro, fare clic su "Ricollega particelle" per ricollegare le particelle rilevate con diversi parametri di intervallo di collegamento e percentile.