Perché misurare la cinetica dello svolgimento del DNA è importante per la validazione della sequenza bersaglio?

La misurazione della cinetica di svolgimento del DNA fornisce un'analisi funzionale diretta della stabilità del nucleosoma, consentendo una valutazione quantitativa dell'interazione con bersagli epigenetici. Questa misurazione supporta la validazione del bersaglio collegando cambiamenti biofisici a esiti trascrizionali in sistemi rilevanti per la malattia. I dati cinetici permettono una riduzione del rischio meccanicistica, chiarificando come i composti influenzino nel tempo la disponibilità della cromatina.

In che modo l'isolamento del nucleosoma come variabile indipendente si inserisce nel percorso di scoperta?

L'isolamento di nucleosomi su un substrato di mica funzionalizzata permette un'osservazione controllata dello svolgimento del DNA senza fattori cellulari interferenti. Questo approccio riduzionistico si adatta alla fase iniziale della scoperta, fornendo un sistema definito per testare gli effetti dei composti sui meccanismi fondamentali della cromatina. Il sistema isolato favorisce lo sviluppo di saggi, offrendo risultati quantitativi e riproducibili per le campagne di screening.

Quali misurazioni quantitative della variabile dipendente consentono l'identificazione del composto attivo?

Le misurazioni temporali dell'altezza dei nucleosomi fungono da variabile dipendente per quantificare gli eventi e la cinetica dello svolgimento del DNA. Queste misurazioni permettono l'identificazione di composti attivi consentendo il confronto diretto degli effetti dei composti sulla stabilità e sulla dinamica dei nucleosomi. I risultati quantitativi supportano l'analisi delle relazioni struttura-attività, correlando le modifiche chimiche ai cambiamenti nel comportamento della cromatina.

Perché i requisiti di replica sono importanti per la collaborazione trasversale?

I requisiti di replicazione garantiscono condizioni costanti di immobilizzazione dei nucleosomi e di acquisizione delle immagini negli esperimenti, aspetti essenziali per una condivisione affidabile dei dati tra gruppi di ricerca. Protocolli standardizzati per la funzionalizzazione della mica e lo scambio di tampone permettono risultati riproducibili, sostenendo gli sforzi collaborativi di validazione degli obiettivi. Una replicazione costante riduce la variabilità nelle misurazioni cinetiche, migliorando l'affidabilità nell'interpretazione dei dati tra diversi progetti.

Quali capacità di analisi statistica sono necessarie prima dell'implementazione?

L'implementazione richiede capacità di analisi cinetica di dati in time-lapse, inclusa la rilevazione di eventi e la determinazione delle costanti di velocità a partire dalle traiettorie dell'altezza dei nucleosomi. Sono necessari strumenti statistici per quantificare le frequenze di svolgimento, i tempi di permanenza e le velocità di transizione tra stati avvolti e disavvolti. Queste capacità analitiche consentono ai gruppi di confrontare condizioni e valutare gli effetti dei composti con il rigore appropriato per prendere decisioni.

Microscopia a forza atomica time-lapse ad alta velocità per catturare la dinamica dei nucleosomi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Tecniche Biologiche

0 visualizzazioni • 4:56 min • July 8th, 2025

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I nucleosomi – unità ripetitive del DNA eucariotico – sono costituiti da segmenti di DNA avvolti attorno a nuclei proteici istonici. Lo srotolamento del DNA attorno al nucleo dell'istone è fondamentale per la dinamica dei nucleosomi.

Per catturare la dinamica dei nucleosomi, iniziare con un substrato di mica liscio e funzionalizzato montato su un microscopio a forza atomica, AFM, stadio scanner. Sovrapporre il substrato con un tampone contenente nucleosomi.

Il DNA nucleosomiale caricato negativamente interagisce con le cariche positive sulla mica funzionalizzata, immobilizzandole sulla superficie. Lavare il substrato di mica immobilizzato con un tampone per evitare il sovraffollamento dei nucleosomi.

Trasferire lo stadio dello scanner contenente nucleosomi in una camera di imaging contenente un cantilever premontato, con una punta sul bordo e rivolta verso l'alto verso i nucleosomi.

Riempire la camera con un tampone di imaging. Allineare il raggio laser sul retro del cantilever per garantire misurazioni accurate della deflessione.

La punta AFM oscilla vicino ai nucleosomi completamente avvolti e scansiona la superficie per misurare l'altezza dei nucleosomi a intervalli regolari.

Lo srotolamento spontaneo del DNA aumenta l'altezza del nucleosoma, alternando le oscillazioni della punta e portando alla deflessione a sbalzo. Questa deflessione a sbalzo sposta la posizione del raggio laser riflesso, che viene rilevato da un rivelatore sensibile alla posizione e produce immagini topografiche dei nucleosomi.

Nelle immagini AFM, il nucleo istonico appare come una macchia luminosa con DNA srotolato di altezze crescenti nel tempo, indicativo della dinamica dei nucleosomi.

Utilizzare la colla per scanner a barre di vetro per fissare un'asta di vetro allo stadio dello scanner AFM. Lasciare asciugare per almeno 10 minuti. Nel frattempo, crea pezzi circolari di mica spessi 0,1 millimetri con un diametro di 1,5 millimetri perforandoli da un foglio di mica più grande. Usa la colla per bacchette di mica-vetro ad alta velocità AFM per attaccare questo pezzo di mica all'asta di vetro sull'AFM ad alta velocità, e lascialo rimanere intatto per un minimo di 10 minuti mentre si asciuga.

Quindi, staccare gli strati dalla mica usando un nastro sensibile alla pressione fino a quando non si vede uno strato ben tagliato sul nastro. Successivamente, diluire 1 microlitro di stock APS da 50 millimolari in 99 microlitri di acqua deionizzata distillata per ottenere una soluzione APS da 500 micromolari. Depositare 2,5 microlitri di soluzione sulla superficie di mica appena tagliata e lasciare che la superficie si funzionalizzi per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, sciacquare più volte la mica con acqua distillata deionizzata applicando risciacqui da 3 microlitri. Rimuovere completamente l'acqua dopo ogni risciacquo posizionando una salvietta in tessuto non tessuto sul bordo della mica. Dopo l'ultimo risciacquo, posizionare 3 microlitri di acqua distillata deionizzata sulla superficie e lasciare riposare per un minimo di 5 minuti per rimuovere eventuali APS non specificamente legati.

Quindi, posizionare la sonda nel supporto AFM ad alta velocità e posizionare il supporto sul palco AFM con la punta rivolta verso l'alto. Sciacquare il supporto utilizzando 100 microlitri di acqua distillata deionizzata, seguito da due risciacqui da 100 microlitri di tampone per l'imaging dei nucleosomi filtrato da 0,22 micron. Terminati i risciacqui, riempire la camera con 100 microlitri di tampone per l'imaging dei nucleosomi, immergendo la punta.

Regolare la posizione del cantilever fino a quando non viene colpita dal laser. Quindi, sciacquare la mica APS cinque volte con un tampone filtrato per l'imaging dei nucleosomi, utilizzando 4 microlitri per risciacquo. Diluire 1 microlitro dello stock di assemblaggio del nucleosoma in 250 microlitri di tampone filtrato per l'imaging del nucleosoma per una concentrazione finale di 1 nanomolare.

Depositare 2,5 microlitri di questa diluizione sulla superficie e lasciare riposare per 2 minuti. Sciacquare la superficie due volte con 4 microlitri di tampone per l'imaging dei nucleosomi per evitare il sovraffollamento. Dopo l'ultimo risciacquo, lasciare la superficie coperta da un tampone di imaging. Posizionare lo scanner e il campione sopra il supporto della punta in modo che il campione sia rivolto verso il basso.

Per iniziare l'avvicinamento, utilizzare la funzione di avvicinamento automatico con un'ampiezza del set point vicina all'ampiezza dell'oscillazione libera. Regolare il punto di regolazione fino a quando la superficie non è ben tracciata. Quindi, impostare l'area dell'immagine da 150 per 150 nanometri a 200 per 200 nanometri con una velocità di acquisizione dati di circa 300 millisecondi per fotogramma di imaging.