Microscopia elettronica a trasmissione per quantificare la distribuzione del glicogeno nei muscoli scheletrici umani

Il glicogeno, un polimero ramificato del glucosio, è una riserva di energia nei compartimenti intermiofibrillari subcellulari, intramiofibrillari e subsarcolemmali all'interno del muscolo scheletrico umano.

Per quantificare la distribuzione subcellulare del glicogeno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, TEM, si ottiene tessuto muscolare scheletrico umano isolato. Fissare con glutaraldeide per preservare la struttura dei tessuti. Postfissare il tessuto in una soluzione di tetrossido di osmio e ferrocianuro di potassio.

Il complesso ossimio-ferrocianuro ridotto si lega ai gruppi ossidrilici nel glicogeno, migliorando il contrasto delle particelle di glicogeno nel muscolo. Inoltre, le membrane e il reticolo sarcoplasmatico – un organello legato alla membrana – si macchiano.

Disidratare il tessuto aumentando le concentrazioni di etanolo. Incastonare in resina, formando un blocco solido. Ottenere sezioni ultrasottili con fibre muscolari orientate longitudinalmente; trasferimento su griglie GST.

Immergere le griglie in acetato di uranile, soluzione di metalli pesanti. Gli ioni uranile si legano ai lipidi e alle proteine caricati negativamente, rendendoli densi di elettroni. Colorare con soluzione di citrato di piombo.

Gli ioni piombo si legano alle regioni colorate di osmio, comprese le particelle di glicogeno, migliorando il contrasto. Si legano anche alle regioni reattive con l'acetato di uranile, intensificando l'opacità degli elettroni.

Durante l'imaging TEM, quando i fasci di elettroni passano attraverso il tessuto, le regioni colorate con densità di elettroni, incluso il glicogeno, disperdono più elettroni, mentre le regioni non colorate trasmettono elettroni.

Nell'immagine TEM ad alto contrasto prodotta, le particelle di glicogeno appaiono distinte e scure; le regioni non colorate appaiono più chiare, facilitando la visualizzazione e la quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nel muscolo.

Isolare un piccolo campione dalla biopsia muscolare o dal muscolo intero, che abbia un diametro massimo di 1 millimetro in qualsiasi direzione e sia più lungo longitudinalmente che trasversalmente.

Posizionare il campione nella provetta contenente la soluzione fredda di fissazione primaria. Conservalo a 5 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, lavare il campione 4 volte in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare. Utilizzando le pipette di trasferimento, rimuovere il tampone usato dalla provetta, lasciando intatto il campione, e aggiungere il tampone fresco. Post-fissare il campione con tetrossido di osmio all'1% e ferrocianuro di potassio all'1,5% in tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 molare per 120 minuti a 4 gradi Celsius.

Sciacquare il campione due volte in acqua bidistillata a temperatura ambiente. Disidratare immergendolo in una serie graduata di etanolo a temperatura ambiente. Infiltrare il campione con ossido di propilene e miscele di resina epossidica a temperatura ambiente utilizzando i rapporti di volume menzionati.

Il giorno seguente, incorporare i campioni in resina epossidica fresca al 100% negli stampi e polimerizzare a 60 gradi Celsius per 48 ore.

Montare il blocco di un campione sul supporto dell'ultramicrotomo. Taglia il blocco sulla superficie con una lama di rasoio per raggiungere il livello del tessuto. Montare un coltello diamantato davanti al campione e allineare la superficie del campione parallelamente al coltello.

Produrre una sezione semisottile di 1 micrometro di spessore con il coltello diamantato per controllare l'orientamento del campione. Colorare la sezione semisottile con blu di toluidina per l'osservazione con microscopia ottica. Quindi, taglia ulteriormente il blocco per ridurre l'area di interesse per ottenere sezioni ultrasottili adeguate.

Taglia sezioni ultrasottili di spessore da 60 a 70 nanometri con un secondo coltello diamantato. Raccogli da 1 a 2 sezioni su griglie di rame a un foro usando un Perfect Loop. Per contrastare le sezioni, immergere le griglie in una soluzione di acetato di uranile per 20 minuti e lavare le griglie in acqua a doppia distillazione, quindi immergere le griglie in citrato di piombo per 15 minuti e lavare nuovamente le griglie in acqua a doppia distillazione.

Accendi il microscopio elettronico a trasmissione, il computer e il software di registrazione delle immagini. Registra immagini digitali con una telecamera CCD digitale a scansione lenta e il software di imaging associato. Dopo aver inserito la griglia con più sezioni nel tavolino del microscopio, esaminare la griglia inizialmente a basso ingrandimento per scegliere le sezioni della migliore qualità e determinare la direzione delle fibre muscolari.

Quindi, mettere a fuoco l'immagine con un ingrandimento superiore a 30.000, con il raggio centrato su una fibra periferica nella sezione, e registrare le immagini con un tempo di esposizione di 1 secondo all'ingrandimento desiderato. Assicurarsi che le immagini siano distribuite su tutta la lunghezza e la larghezza della fibra in un ordine casuale, ma sistematico per ottenere risultati imparziali, e ripetere l'imaging fino a quando non vengono visualizzate da 6 a 10 fibre.

Importa le immagini in imageJ facendo clic su File, seguito da Apri. Imposta la scala globale in modo che corrisponda alle dimensioni originali dell'immagine facendo clic su Analizza, quindi su Imposta scala. Per ingrandire al 100%, fai clic su Immagine, vai su Zoom e fai clic su In.

Misurare lo spessore di un disco Z per immagine dello spazio miofibrillare, utilizzando lo strumento Linea retta dal menu Strumenti, e calcolare lo spessore medio del disco Z di ciascuna delle 6-10 fibre. Utilizzare lo strumento Linea segmentata per misurare la lunghezza della miofibrilla più esterna, visibile appena sotto la regione sottosarcolemmale.

Per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare Strumenti, quindi selezionare Griglia. Ora imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi all'interno della lunghezza disponibile, nelle 12 immagini subsarcolemmali in cui una croce colpisce il glicogeno subsarcolemmale.

Inserisci una griglia facendo clic su Analizza, quindi seleziona Strumenti, seguito da Griglia e imposta l'area per punto a 160.000 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce lo spazio intramiofibrillare.

Quindi di nuovo, per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare Strumenti e, quindi, selezionare Griglia. Ora, imposta l'area per punto a 3.600 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari in cui una croce colpisce il glicogeno intramiofibrillare.

Inserisci una griglia facendo clic su Analizza, quindi seleziona Strumenti, seguito da Griglia e imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari in cui una croce colpisce il glicogeno intermiofibrillare.

Utilizzando la griglia di 32.400 nanometri quadrati per scegliere casualmente le particelle di glicogeno, inizia con il quadrato in alto a sinistra e spostati a sinistra se necessario. Utilizzando lo strumento Straight Line, misurare il diametro di 5 particelle di glicogeno scelte casualmente di ciascuna piscina per ciascuna delle 12 immagini per ottenere una media di 60 particelle per piscina per fibra.