Microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi microvascolari

La microscopia a fluorescenza intravitale è utile per studiare l'induzione fototossica della formazione di un trombo - un coagulo di sangue - in un sito di lesione microvascolare.

Inizia prendendo un topo glabro anestetizzato iniettato con un polisaccaride fototossico marcato con fluoroforo. Posizionare il mouse in posizione prona su una piattaforma riscaldante per mantenere la temperatura fisiologica per una corretta circolazione sanguigna.

Posizionare la parte apicale dell'orecchio sotto un microscopio a fluorescenza intravitale. Dopo l'eccitazione con la luce, il fluoroforo emette fluorescenza, consentendo il monitoraggio del flusso sanguigno microvascolare. Aumentare l'intensità della luce per indurre la formazione di trombi.

Il fluoroforo assorbe la luce ad alta intensità e reagisce con l'ossigeno molecolare per generare specie reattive dell'ossigeno. Queste molecole causano stress ossidativo nelle cellule endoteliali, portando così al danno cellulare e all'esposizione della matrice subendoteliale.

Le cellule danneggiate rilasciano mediatori trombotici che collegano il collagene esposto nella matrice subendoteliale e le piastrine circolanti, che si legano ai mediatori tramite specifici recettori.

Il legame attiva le piastrine, provocando il rilascio di molecole effettrici che attivano e reclutano altre piastrine circolanti nel sito della lesione. Le proteine del fibrinogeno circolanti si legano ai recettori del fibrinogeno sulle piastrine attivate, collegandole per formare un tappo piastrinico.

Visualizza il flusso sanguigno limitato per confermare il tappo piastrinico, la fase principale della formazione dei trombi.

Posizionare l'animale sulla piattaforma sotto lo stereomicroscopio. Usa l'ingrandimento 10X. Per la microscopia dell'orecchio destro, preparare la vena giugulare sinistra creando prima un'incisione di 5 millimetri nella pelle del collo in direzione cranio-caudale. Quindi, utilizzare micro-pinze e microforbici per sezionare il tessuto sottocutaneo. Quindi, liberare la vena dalla sua avventizia senza toccare il vaso.

Ora, usa la siringa da insulina precedentemente preparata per l'iniezione del colorante fluorescente. Afferrare con cautela la parete del vaso con le micro-pinze senza perforare la vena. Penetrare la parete del vaso disteso con l'ago della siringa e iniettare FITC-destrano per via endovenosa. Estrarre l'ago e fermare l'emorragia utilizzando tamponi di cotone. Evitare la contaminazione da sangue e coloranti dell'orecchio.

Trasferisci l'animale sulla piastra riscaldante su una struttura in vetro acrale con una fessura per la piastra riscaldante e un piano alto 0,5 centimetri per posizionare l'orecchio. Fissare l'animale in posizione prona sulla piastra riscaldante utilizzando una benda adesiva. Posizionare la cartilagine convessa alla base dell'orecchio accanto al piano per l'orecchio in modo che la parte apicale dell'orecchio possa essere posizionata piatta sul piano. Aggiungi una goccia di acqua a temperatura ambiente alla lastra di vetro acrale. Usando dei tamponi di cotone, assorbi la goccia d'acqua e lascia che le forze capillari attacchino il piano dell'orecchio al vetro acrale.

Il padiglione auricolare deve essere posizionato il più piatto possibile, anche se la cartilagine conferisce al padiglione auricolare una forma convessa. Quindi, solo la parte distale più flessibile del padiglione auricolare dovrebbe essere posizionata sulla lastra di vetro acrale. Per evitare danni ai tessuti e stravaso del colorante congelato, toccare l'orecchio il meno possibile con la pinza.

Quindi, aggiungi una goccia di acqua sul lato dorsale convesso dell'orecchio. Applicare con cura un vetrino coprioggetti sull'orecchio senza comprimere i vasi basali che entrano nell'orecchio. Utilizzare tamponi di cotone per rimuovere quanta più acqua possibile da sotto il vetrino coprioggetti, per ridurre al minimo la distanza tra il vetrino coprioggetti e i vasi bersaglio dell'orecchio.

Iniziare regolando il microscopio a fluorescenza intravitale per la visualizzazione FITC-destrano. Trasferire l'animale preparato sulla scrivania del microscopio a fluorescenza intravitale. Utilizzando un ingrandimento 5X, 10X e 20X e un'intensità luminosa del 20%, cerca un vaso venoso di 50-60 micron di diametro e con un flusso sanguigno anterogrado.

Aggiungere una goccia di acqua a temperatura ambiente al vetrino coprioggetti per l'immersione in acqua dell'obiettivo con ingrandimento 63X. Immediatamente dopo l'applicazione della goccia d'acqua, iniziare a registrare il vaso per 20 secondi per la valutazione di base del diametro e del flusso sanguigno. Iniziare l'induzione del trombo 5 minuti dopo l'iniezione di FITC-destrano. A tale scopo, aumentare l'intensità della luce al 100%.

Durante l'induzione di trombi fototossici, chiudere l'apertura del microscopio per 2 secondi entro un periodo di 30 secondi per verificare l'occlusione del flusso sanguigno. Se il flusso sanguigno persiste, aprire nuovamente l'apertura. Il vaso è classificato come occluso se il flusso rimane fermo per 30 secondi o più o se il flusso sanguigno è retrogrado. Selezionare e occludere cinque vasi per orecchio entro un periodo di 1 ora dall'iniezione di FITC-destrano.