Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare per identificare fosforilazioni multiple nelle proteine

Le fosforilazioni multiple in una proteina comportano l'aggiunta di gruppi fosfato alla proteina in varie posizioni, in particolare ai residui di serina e treonina.

Per identificare più fosforilazioni in una proteina, iniziare con una provetta contenente proteine fosforilate marcate con azoto-15, che aiuta a differenziare gli idrogeni ammidici dagli altri idrogeni nella proteina.

Aggiungere un composto di riferimento NMR interno per una misurazione accurata delle frequenze di risonanza relative. Trasferire la miscela in un tubo di risonanza magnetica nucleare, o NMR. Inserire il tubo in un'apertura rotante e posizionarlo in uno spettrometro NMR.

La presenza di fosfati mostra effetti di ritiro di elettroni nei residui fosforilati di serina e treonina. Di conseguenza, gli idrogeni ammidici dei residui fosforilati sembrano essere deschermati con densità di elettroni inferiori rispetto agli altri idrogeni ammidici.

Gli idrogeni ammidici con ambienti elettronici variabili sperimentano campi magnetici differenziali attorno ai nuclei, raggiungendo stati di bassa energia.

Applicare un breve impulso a radiofrequenza per eccitare i nuclei di idrogeno a uno stato energetico più elevato a una frequenza di risonanza specifica in base al loro ambiente elettronico.

Durante il rilassamento, i nuclei ritornano a uno stato di bassa energia rilasciando l'energia assorbita, che viene rilevata per produrre un segnale NMR.

Tracciare uno spettro NMR bidimensionale che rappresenta i singoli idrogeni ammidici.

Confrontare lo spettro della proteina fosforilata con quello della proteina non fosforilata. La comparsa di risonanze aggiuntive nello spettro NMR della proteina fosforilata conferma molteplici fosforilazioni.

Solubilizzare 4 milligrammi di Tau liofilizzato ¹⁵N e ¹³C arricchito con ERK in 400 microlitri di tampone NMR. Aggiungere il 5% di ossido di deuterio per il blocco del campo dello spettrometro NMR e 1 millimolare di TMSP come riferimento del segnale NMR interno. Inoltre, aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre 40x di un cocktail completo di inibitori della proteasi.

Trasferire il campione in una provetta NMR da 5 millilitri utilizzando una siringa elettronica con ago lungo o utilizzando una pipetta Pasteur. Chiudere il tubo NMR utilizzando lo stantuffo. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra lo stantuffo e il liquido muovendo lo stantuffo.

Posizionare il tubo NMR in uno spinner. Utilizzare il calibro appropriato per regolare la sua posizione verticale nello spinner, in modo tale che la maggior parte della soluzione del campione si trovi all'interno della bobina NMR. Quindi, avviare il flusso d'aria nello strumento NMR facendo clic su "Solleva" nella finestra del sistema di controllo del magnete. Posizionare con cautela lo spinner con il tubo nel flusso d'aria nella parte superiore del foro del magnete, quindi arrestare il flusso d'aria e lasciare che il tubo scenda in posizione all'interno della testa della sonda all'interno del magnete.

Dopo aver lasciato che il campione si equilibrasse a 25 gradi Celsius, digitare "atmm" nella riga di comando per eseguire la regolazione e l'abbinamento semiautomatici della testa della sonda per ottimizzare la trasmissione di potenza. Quindi, fare clic su "Blocca" nella finestra del sistema di controllo del magnete per attivare il blocco della frequenza di campo dello spettrometro.

Avviare la procedura di spessoramento per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico nella posizione del campione digitando prima "topshim gui" sulla riga di comando per aprire la finestra di spessore. Quindi, fai clic su "Avvia" nella finestra dello shim. Controllare lo scostamento standard residuo B zero per verificare che gli spessori siano ottimali.

Quindi, calibrare il parametro P1, che è la lunghezza di un impulso a radiofrequenza protonica in microsecondi. Questo parametro è necessario per ottenere una rotazione di 90 gradi della magnetizzazione dello spin del protone. Punta all'impulso a 360 gradi utilizzando uno spettro unidimensionale di protoni d'acqua.

Regolare l'offset di frequenza impostando il parametro 01 sulla frequenza dell'acqua protonica nello spettro unidimensionale. Infine, inizia l'acquisizione di uno spettro protonico unidimensionale digitando 'zg' nella riga di comando.