Un test immunologico diretto basato sulla spettroscopia Raman per rilevare un antigene specifico

Inizia incubando le molecole di colorante reporter Raman con nanoparticelle d'oro affinché i reporter si leghino alle nanoparticelle.

Aggiungere glicole polietilenico, anticorpi coniugati con PEG specifici per l'antigene bersaglio. Gli anticorpi si attaccano covalentemente alle nanoparticelle attraverso il legame oro-disolfuro. Aggiungere PEG coniugati con tiolo per bloccare i restanti siti di nanoparticelle e prevenire l'aggregazione di nanoparticelle, formando sonde di nanoparticelle.

Rivestire i pozzetti della piastra di immunodosaggio con l'antigene bersaglio. Bloccare i restanti siti della piastra con una soluzione contenente proteine. Aggiungi le sonde di nanoparticelle. Eseguire la diluizione seriale della sonda attraverso i pozzetti. Incubare affinché gli anticorpi nelle sonde si leghino agli antigeni, formando complessi.

Utilizzare un microscopio Raman per determinare la risposta ottica della sonda. Il laser monocromatico incidente eccita gli elettroni superficiali delle nanoparticelle d'oro e ne provoca l'oscillazione, creando un elevato campo elettromagnetico locale sulla superficie della sonda.

Il raggio incidente e i reporter Raman interagiscono, causando una maggiore luce anelastica o diffusione Raman con diverse lunghezze d'onda e frequenze a causa del campo elettromagnetico potenziato. Il segnale Raman emesso in modo anelastico viene utilizzato per generare lo spettro Raman.

Tracciare l'area spettrale del picco del reporter Raman rispetto alla concentrazione della sonda per trovare il limite inferiore di rilevamento della sonda e facilitare un rilevamento più sensibile dell'antigene.

Per preparare le sonde Raman, fare prima due lotti da 1,5 millilitri di nanoparticelle d'oro e il reporter Raman alle concentrazioni determinate come descritto nel protocollo di testo allegato.

Questo viene fatto combinando il reporter Raman e le soluzioni di nanoparticelle d'oro e lasciandole legare per oltre 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la soluzione di anticorpi PEGilati a una delle soluzioni di nanoparticelle d'oro legate al reporter per creare un rapporto di 200 a 1 tra anticorpi e particelle. Questa soluzione sarà per i campioni di prova.

In una provetta da microcentrifuga separata, aggiungere un antigene PEGilato all'altra soluzione di nanoparticelle d'oro legata al reporter con un rapporto di 200 a 1 tra antigene e particelle da utilizzare come controllo. Incubare entrambe le soluzioni per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, bloccare i siti rimanenti sulla superficie della nanoparticella. Per ottenere ciò, in primo luogo, sciogliere il metossi polietilenglicole tiolo solido a una concentrazione di 200 micromolari utilizzando acqua HPLC. Agitare la soluzione fino a quando il tiolo non è completamente sciolto. Quindi, aggiungere la soluzione di tiolo in un rapporto di 40.000 a 1 alle soluzioni di anticorpi PEG legate a nanoparticelle e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 minuti per assicurarsi che i siti rimanenti sulla nanoparticella d'oro siano bloccati.

Successivamente, recuperare le sonde Raman funzionalizzate centrifugando le particelle in provette da centrifuga a basso legame in modo che il surnatante sia limpido. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio, ma fare attenzione a non disturbare le nanoparticelle. Quindi, risospendere le nanoparticelle con 1 millilitro di PBS.

Stimare la concentrazione di nanoparticelle d'oro effettuando una misurazione UV-Visibile da circa tre microlitri della soluzione e confrontare i risultati con quelli di una concentrazione nota di nanoparticelle d'oro poiché si tratta di una relazione lineare.

Se le nanoparticelle non sono sufficientemente bloccate, si aggregheranno a causa delle forze di adesione tra le particelle, suggerendo che i reagenti sono stati aggiunti alle concentrazioni errate. Normalmente, la soluzione è di un colore rosso intenso ma l'aggregazione crea una tonalità grigia.

Regolare il volume in modo che le soluzioni finali siano almeno 1 x 10¹¹ particelle per millilitro e conservare le soluzioni a 4 gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzate per funzionalizzare la piastra di immunodosaggio. Usa queste soluzioni entro una settimana. Per prima cosa, preparare una quantità sufficiente di antigene diluito per riempire i pozzetti di polistirene. Quindi, agitare la soluzione e aggiungere immediatamente la soluzione ai pozzetti delle piastre.

Lasciare che l'antigene si leghi alle piastre per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere la soluzione di antigene in eccesso scaricando la soluzione e colpendo la piastra contro un piano del tavolo coperto di carta assorbente. Aggiungere TBST ai pozzetti per lavare la superficie. Quindi, rimuovere il lavaggio scaricando nuovamente la soluzione e colpendo il piatto contro un piano del tavolo ricoperto di carta assorbente.

Quindi, bloccare i siti di legame rimanenti sulla piastra per evitare il legame aspecifico aggiungendo 70 microlitri di soluzione bloccante HSA a ciascun pozzetto della piastra e incubando la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, rimuovere la soluzione bloccante e sciacquare la piastra tre volte con TBST, come precedentemente dimostrato. Dopo aver rimosso l'ultimo risciacquo, coprire il piatto e conservarlo asciutto a 4 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Aggiungere 140 microlitri di nanoparticelle della sonda precedentemente preparate nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti, posizionando le nanoparticelle di prova nelle prime cinque file e le nanoparticelle di controllo nelle ultime tre righe. Aggiungere 70 microlitri di PBS a tutte le altre colonne.

Diluire ogni colonna con una diluizione seriale da 1 a 2. Inizia prendendo 70 microlitri dalla prima colonna e mescolandoli con la seconda. Quindi, prendi 70 microlitri dalla seconda colonna e aggiungili alla terza, e così via. Lasciare incubare la piastra per almeno un'ora.

Quindi, rimuovere le sonde di nanoparticelle non legate e lavare la piastra con TBST cinque volte come precedentemente dimostrato. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 70 microlitri di PBS in ogni pozzetto e coprire la piastra con un sigillo per piastre. Verificare che i campioni di controllo siano chiari. Se si è verificato un legame non specifico, i campioni di controllo avranno un colore simile a quello dei campioni di test.

Utilizzando un microscopio Raman invertito, focalizzare l'obiettivo sulla superficie del pozzetto che ha le sonde di nanoparticelle d'oro. Ottieni gli spettri Raman del pozzo. Raccogli uno spettro che va da 1800 centimetri inversi a 400 centimetri inversi e ripeti l'operazione per ogni pozzo. Infine, seguire i passaggi nella sezione finale del protocollo di testo allegato per determinare la sensibilità della configurazione.