Name: Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Impara a rilevare la contaminazione da Mycoplasma nelle colture cellulari con il kit PCR LookOut. Questo metodo include preparazione del campione, amplificazione termica ed elettroforesi su gel di agarosio per risultati affidabili.

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Finanziato dalla Sigma-Aldrich

1. Rilevamento micoplasma <ol><li> Surnatanti di coltura cellulare può essere verificata direttamente oppure il campione può predisposti per essere utilizzati in un secondo momento. Per preparare per un uso successivo posto 100 l di surnatante in un tubo di amplificazione sterile e incubare ° C per 5 minuti. A 95 Una volta che questo è completo il campione può essere conservato a 2-8 ° C per un massimo di una settimana. Poco prima di eseguire la centrifuga brevemente campione (5 secondi) per far sedimentare i detriti cellulari. </li><li> Per preparare i campioni per PCR, determinare il volume totale di Jumpstart Taq DNA polimerasi / reidratazione buffer necessaria per le reazioni. Ci prepareremo 5 reazioni totale. Cinque reazioni richiederà 2.5μl di Taq e 114.5μl di tampone di reidratazione. Questo conterrà un minimo di una unità di Taq per reazione e 22.5μl di tampone di reidratazione per reazione del campione e di controllo negativo, più 24.5μl di tampone di reidratazione per il controllo positivo. 1 unità di DNA polimerasi per reazione deve essere aggiunto al volume adeguato di tampone di reidratazione. Questo varia a seconda del Taq utilizzato. </li><li> Posizionare il volume calcolato di Taq DNA polimerasi in una provetta pulita e seguire con il volume calcolato di buffer di reidratazione. La polimerasi / reidratazione buffer di DNA deve essere mescolato delicatamente muovendo il tubo. Questa miscela non dovrebbero essere posti in agitazione. </li><li> Per preparare il controllo negativo e campioni di utilizzare i tubi di reazione trasparente fornito nel kit. I tubi di reazione forniti nel kit contengono già la nuclueotides, primer e DNA di controllo interno. 23 ml di mix Jumpstart di buffer Taq DNA polimerasi / reidratazione, così come redatto nei passi precedenti, deve essere posto in ciascuno dei controllo negativo e provette. Aggiungere 2 ml di acqua DNA libero per il controllo negativo e aggiungere 2 ml di campione per ognuna delle provette dei campioni e l'etichetta. Mescolare il contenuto di sfogliando i tubi. Contenuti non devono essere posti in agitazione. </li><li> Per preparare il controllo positivo utilizzare i tubi di reazione rosa fornito nel kit. I tubi di reazione forniti nel kit contengono già la nuclueotides, primer e DNA di controllo interno. Aggiungere 25 ml di mix Jumpstart di buffer Taq DNA polimerasi / reidratazione, così come redatto nei passaggi precedenti, per i tubi di reazione e l'etichetta. Mescolare il contenuto di sfogliando i tubi. Contenuti non devono essere posti in agitazione. Incubare il controllo negativo, controllo positivo e provette a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Per la PCR che si terrà i campioni devono essere collocati in un termociclatore. Quando si utilizza JumpStart Taq un passo di attivazione non è necessario. Posizionare le provette nel termociclatore. I cicli deve essere impostato come segue: 94 ° C per 30 secondi, 55 ° C per 30 secondi e 72 ° C per 40 secondi. Questi cicli verrà eseguito 40 volte. </li><li> Una volta che i cicli di PCR hanno completato i campioni devono essere raffreddata a 4-8 ° C per rimuoverli dal termociclatore e mettendo in ghiaccio. Quando i campioni si sono raffreddati essi dovrebbero essere caricati sul gel di agarosio per l'elettroforesi. Gel di carico e coloranti non sono necessari in quanto sono già presenti nei tubi di reazione. Direttamente carico di 8 microlitri per ogni PCR in una corsia separata. Fermare il elettroforesi dopo la migrazione di 2,5 - 3,0 centimetri. </li></ol> 2. Rappresentante Risultati Il controllo negativo dovrebbe mostrare una banda a circa 481 bp. Questo può essere visto nella colonna di controllo negativo sul gel elettroforesi che viene mostrato all'inizio del video. L'assenza della banda di controllo negativo a 481 bp è un buon indicatore che l'attività della polimerasi non era sufficienttaq utilizzato non era abbastanza sensibile. Mycoplasma campioni positivi mostrano bande nel range di 270 ± 8 bp. La band sarà pesante per i campioni altamente contaminati e debole per i campioni leggermente contaminati. Le variazioni di intensità può essere visto nelle colonne campione positivo sul gel elettroforesi che viene mostrato all'inizio del video. Tutti i campioni contengono un controllo interno negativo per dimostrare che la PCR si è verificato come previsto. E 'normale vedere l'assenza del controllo interno su campioni altamente contaminati. Se non c'è una banda nel range positivo o una band in campo negativo sul vostro campione questo è un buon indicatore che i campioni sono inibite. Se il campione è inibito il inibitori della PCR può essere rimosso effettuando una estrazione del DNA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg"> Bande Amplicon Figura 1 rilevanti:. Risultati di rilevare micoplasma mediante PCR sono mostrati. Corsia 2 è il controllo negativo, che dovrebbe mostrare una banda di circa 481 bp. L'assenza della banda di controllo negativo a 481 bp è un buon indicatore che la Taq utilizzato non era abbastanza sensibile. Mycoplasma campioni positivi mostrerà bande nel range di 270 + 8 bp come mostrato in corsie 3 - 6. La band sarà heavy per campioni altamente contaminati (corsia 6) e leggermente debole per i campioni contaminati (corsia 4). Tutti i campioni contengono un controllo interno negativo (481 bp) per dimostrare che la PCR si è verificato come previsto. E 'normale vedere l'assenza del controllo interno su campioni altamente contaminati.

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti di Sigma-Aldrich che ha prodotto i reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

A causa della estrema sensibilità del kit, se eseguita correttamente il kit devono fornire risultati precisi che indicano se il campione è la contaminazione da micoplasma. Il kit è stato ottimizzato per l&#39;utilizzo con JumpStart Taq DNA polimerasi. Taqs altri possono essere utilizzati nella preparazione dei campioni, ma la banda di controllo interno a 481 bp dovrebbe essere presente per indicare la sensibilità corretta l&#39;alternativa Taq. E &#39;possibile per le bande positivo ad esporre densità diverse a seconda del livello di contaminazione. E &#39;possibile osservare l&#39;assenza della banda di controllo interno su campioni fortemente contaminati. Usando cautela e tecnica adeguata per la preparazione dei campioni per evitare la contaminazione sono cruciali per il corretto. quando si utilizza il rilevamento LookOut Mycoplasma Detection Kit PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart Taq DNA polimerasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute Sangue kit del DNA genomico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Tubi di amplificazione Nunc </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

ottimizzati basati sulla pcr rilevazione di mycoplasma

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Il mantenimento di contaminazione senza linee di cellule è indispensabile per cellulari basati su ricerche. Tra le maggiori preoccupazioni dei contaminanti sono la contaminazione da micoplasma. Anche se micoplasma di solito non uccidono le cellule contaminate, sono difficili da rilevare e possono causare una serie di effetti sulle cellule in coltura, tra cui alterato metabolismo, rallentato proliferazione e aberrazioni cromosomiche. In breve, la contaminazione da micoplasma compromette il valore di tali linee cellulari nel fornire dati accurati per la ricerca delle scienze della vita. Le fonti di contaminazione da micoplasma in laboratorio sono molto difficili da controllare completamente. Come alcune specie di micoplasmi sono presenti sulla cute umana, possono essere introdotte attraverso povero tecnica asettica. Inoltre, possono venire dagli integratori contaminati come siero fetale bovino e, soprattutto, dalle altre colture di cellule contaminate. Una volta micoplasma contamina una cultura, può rapidamente diffondersi di contaminare altre aree del laboratorio. Rispetto rigoroso di buone pratiche di laboratorio, come buona tecnica asettica sono fondamentali, e di routine per il micoplasma è altamente consigliato per un controllo adeguato della contaminazione da micoplasma. Basati sulla PCR rilevazione di micoplasmi è diventato un metodo molto popolare per la manutenzione ordinaria linea cellulare. Basati sulla PCR metodi di rilevamento sono altamente sensibili e in grado di fornire risultati rapidi, che permette ai ricercatori di rispondere rapidamente ad isolare ed eliminare la contaminazione una volta che viene rilevato in confronto al tempo necessario utilizzando tecniche microbiologiche. Il LookOut Mycoplasma Detection Kit PCR è molto sensibile, con un limite di rilevazione di soli 2 genomi per microlitri. Approfittando della DNA polimerasi altamente specifici JumpStart Taq e un design fondo di proprietà, i falsi positivi sono notevolmente ridotte. Il comodo formato 8-tubo, strisce pre-rivestiti con dNTPs e primers associati aiuta ad aumentare la produttività per soddisfare le esigenze dei clienti con i più grandi collezioni di linee cellulari. Data l&#39;estrema sensibilità del kit, grande cura deve essere presa per evitare la contaminazione accidentale di campioni e reagenti. Il passo-passo protocollo dimostriamo mette in evidenza le precauzioni e le pratiche necessarie per il rilevamento affidabile micoplasma. Abbiamo anche mostrare e discutere i risultati tipici e la loro interpretazione. Il nostro obiettivo è quello di garantire il successo di ricercatori che utilizzano il LookOut Mycoplasma Detection Kit PCR.

Il LookOut Mycoplasma Detection Kit PCR sfrutta la reazione a catena della polimerasi (PCR), che è stabilito come metodo di scelta per la massima sensibilità nella rilevazione di contaminazione Mycoplasma, Acholeplasma e Ureaplasma in colture cellulari e di colture cellulari di altri derivati ​​biologici.

Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

Il mantenimento di linee cellulari prive di contaminazioni è essenziale per la ricerca basata su cellule. Tra le maggiori preoccupazioni relative ai contaminanti figura la contaminazione da micoplasma. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare visivamente i passaggi per l'utilizzo del kit di rilevamento PCR per micoplasmi Lookout, ottimizzato per rilevare la contaminazione da micoplasmi. Questo viene ottenuto innanzitutto riscaldando i campioni a 95 gradi Celsius per inattivare eventuali molecole di DNA che potrebbero rendere il template desiderato non adatto alla PCR. Successivamente, preparare i campioni per la PCR utilizzando le provette fornite, pre-caricate con nucleotidi, primer e DNA di controllo interno.Il terzo passaggio della procedura consiste nel ciclaggio termico in condizioni accuratamente ottimizzate per ottenere la massima sensibilità ed eliminare l'amplificazione non specifica. Infine, i risultati possono essere ottenuti per determinare se i campioni in questione sono contaminati da micoplasma mediante valutazione tramite elettroforesi su gel agarosio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i reagenti sono pre aqutici e provette PCR di alta qualità.Questo lo rende più comodo ed efficiente. Un altro vantaggio di questo kit è che richiede meno di due genomi di micoplasma per microlitro di campione per rilevare la contaminazione. Quando si esegue la procedura per il rilevamento dei micoplasmi, è importante evitare qualsiasi possibile contaminazione utilizzando un idoneo equipaggiamento di protezione personale per ridurre al minimo l'esposizione della pelle, assicurandosi che tutti i reagenti utilizzati siano privi di contaminazione e mantenendo in ogni momento un'adeguata tecnica asettica.La procedura può essere eseguita direttamente sui supernatanti di colture cellulari oppure i campioni possono essere preparati per un utilizzo successivo. Per preparare i campioni per un uso futuro, aggiungere 100 microlitri di ciascun supernatante in un tubo di amplificazione sterile e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, i campioni possono essere conservati da due a otto gradi Celsius per un massimo di una settimana.Subito prima di analizzare i campioni, centrifugare brevemente per raccogliere qualsiasi detrito cellulare. Per preparare i campioni per la PCR, determinare innanzitutto il volume totale di tampone di reidratazione della DNA polimerasi necessario per le reazioni. Un'unità di DNA polimerasi per ogni reazione deve essere aggiunta al volume appropriato di tampone di reidratazione, che varia a seconda del TAC utilizzato; in questa dimostrazione verrà utilizzato il jumpstart TAC D 93 0 7 in cinque reazioni, tre campioni più un controllo positivo e un controllo negativo.Introdurre il volume calcolato di DNA polimerasi in una provetta pulita per microcentrifuga e aggiungere successivamente il volume calcolato di buffer di reidratazione. Mescolare delicatamente il buffer di reidratazione della DNA polimerasi agitando leggermente la provetta. Non vortexare questa miscela.Utilizzare le provette trasparenti per le reazioni fornite nel kit per preparare il controllo negativo e i campioni. Queste provette contengono già nucleotidi, primer e DNA del controllo interno; pipettare 23 microlitri del tampone di reidratazione della DNA polimerasi precedentemente preparato. Mescolare in ciascuna delle provette del controllo negativo e dei campioni.Quindi aggiungere due microlitri di acqua priva di DNA al controllo negativo e due microlitri di ciascun campione ai rispettivi tubi del campione. Mescolare il contenuto agitando leggermente i tubi. Il contenuto non deve essere vorticoso.Per preparare il controllo positivo, utilizzare le provette reattive rosa fornite nel kit. Queste provette contengono già i nucleotidi, i primer e il DNA del controllo interno; aggiungere 25 microlitri di mix tampone per la reidratazione della DNA polimerasi alla provetta reattiva. Mescolare il contenuto agitando delicatamente la provetta; non vortexare. Quindi incubare i tubi del controllo positivo, del controllo negativo e dei campioni a temperatura ambiente per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, trasferire tutti i tubi di reazione su un termociclatore. Per la PCR, impostare le seguenti condizioni per 40 cicli.94 gradi Celsius per 30 secondi. 55 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 40 secondi. Un passaggio di attivazione non è richiesto quando si utilizza Jumpstart tack.Una volta completati i cicli della PCR, rimuovere i campioni dal termociclatore e posizionarli sul ghiaccio per raffreddarli a quattro-otto gradi Celsius. I campioni possono quindi essere caricati direttamente su un gel di agarosio per elettroforesi, caricando otto microlitri per ogni reazione PCR in una corsia separata. Non è necessario aggiungere buffer e colorante prima del caricamento dei campioni poiché sono già inclusi nei tubi di reazione.Interrompere l'elettroforesi dopo che il colorante di corsa ha migrato da 2,5 a tre centimetri. I risultati rappresentativi della rilevazione di micoplasmi mediante PCR sono mostrati in questa immagine di una corsia di gel aros. Il numero due è il controllo negativo, che dovrebbe mostrare una banda a circa 481 paia di basi.L'assenza della banda del controllo negativo a 481 paia di basi è un buon indicatore del fatto che il TAC utilizzato non era sufficientemente sensibile. I campioni positivi per micoplasmi mostreranno bande nell'intervallo di 270 più o meno otto paia di basi, come mostrato nelle corsie da tre a sei. La banda sarà intensa nei campioni altamente contaminati e debole in quelli leggermente contaminati.Tutti i campioni contengono un controllo negativo interno per dimostrare che la PCR è avvenuta come previsto. È normale osservare l'assenza del controllo interno in campioni altamente contaminati. L'assenza di una banda sia nel range positivo che in quello negativo, come mostrato nella corsia sette, è un buon indicatore del fatto che i campioni sono inibiti.Se il campione è inibito. Gli inibitori della PCR possono essere rimossi eseguendo un'estrazione del DNA. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire tutti i passaggi necessari indicati nella procedura del kit, nonché di come interpretare i risultati e risolvere i problemi quando necessario.

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