Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare visivamente i passaggi per l'utilizzo del kit di rilevamento PCR per micoplasmi Lookout, ottimizzato per rilevare la contaminazione da micoplasmi. Questo viene ottenuto innanzitutto riscaldando i campioni a 95 gradi Celsius per inattivare eventuali molecole di DNA che potrebbero rendere il template desiderato non adatto alla PCR. Successivamente, preparare i campioni per la PCR utilizzando le provette fornite, pre-caricate con nucleotidi, primer e DNA di controllo interno.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel ciclaggio termico in condizioni accuratamente ottimizzate per ottenere la massima sensibilità ed eliminare l'amplificazione non specifica. Infine, i risultati possono essere ottenuti per determinare se i campioni in questione sono contaminati da micoplasma mediante valutazione tramite elettroforesi su gel agarosio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i reagenti sono pre aqutici e provette PCR di alta qualità.

Questo lo rende più comodo ed efficiente. Un altro vantaggio di questo kit è che richiede meno di due genomi di micoplasma per microlitro di campione per rilevare la contaminazione. Quando si esegue la procedura per il rilevamento dei micoplasmi, è importante evitare qualsiasi possibile contaminazione utilizzando un idoneo equipaggiamento di protezione personale per ridurre al minimo l'esposizione della pelle, assicurandosi che tutti i reagenti utilizzati siano privi di contaminazione e mantenendo in ogni momento un'adeguata tecnica asettica.

La procedura può essere eseguita direttamente sui supernatanti di colture cellulari oppure i campioni possono essere preparati per un utilizzo successivo. Per preparare i campioni per un uso futuro, aggiungere 100 microlitri di ciascun supernatante in un tubo di amplificazione sterile e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, i campioni possono essere conservati da due a otto gradi Celsius per un massimo di una settimana.

Subito prima di analizzare i campioni, centrifugare brevemente per raccogliere qualsiasi detrito cellulare. Per preparare i campioni per la PCR, determinare innanzitutto il volume totale di tampone di reidratazione della DNA polimerasi necessario per le reazioni. Un'unità di DNA polimerasi per ogni reazione deve essere aggiunta al volume appropriato di tampone di reidratazione, che varia a seconda del TAC utilizzato; in questa dimostrazione verrà utilizzato il jumpstart TAC D 93 0 7 in cinque reazioni, tre campioni più un controllo positivo e un controllo negativo.

Introdurre il volume calcolato di DNA polimerasi in una provetta pulita per microcentrifuga e aggiungere successivamente il volume calcolato di buffer di reidratazione. Mescolare delicatamente il buffer di reidratazione della DNA polimerasi agitando leggermente la provetta. Non vortexare questa miscela.

Utilizzare le provette trasparenti per le reazioni fornite nel kit per preparare il controllo negativo e i campioni. Queste provette contengono già nucleotidi, primer e DNA del controllo interno; pipettare 23 microlitri del tampone di reidratazione della DNA polimerasi precedentemente preparato. Mescolare in ciascuna delle provette del controllo negativo e dei campioni.

Quindi aggiungere due microlitri di acqua priva di DNA al controllo negativo e due microlitri di ciascun campione ai rispettivi tubi del campione. Mescolare il contenuto agitando leggermente i tubi. Il contenuto non deve essere vorticoso.

Per preparare il controllo positivo, utilizzare le provette reattive rosa fornite nel kit. Queste provette contengono già i nucleotidi, i primer e il DNA del controllo interno; aggiungere 25 microlitri di mix tampone per la reidratazione della DNA polimerasi alla provetta reattiva. Mescolare il contenuto agitando delicatamente la provetta; non vortexare.

Quindi incubare i tubi del controllo positivo, del controllo negativo e dei campioni a temperatura ambiente per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, trasferire tutti i tubi di reazione su un termociclatore. Per la PCR, impostare le seguenti condizioni per 40 cicli.

94 gradi Celsius per 30 secondi. 55 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 40 secondi. Un passaggio di attivazione non è richiesto quando si utilizza Jumpstart tack.

Una volta completati i cicli della PCR, rimuovere i campioni dal termociclatore e posizionarli sul ghiaccio per raffreddarli a quattro-otto gradi Celsius. I campioni possono quindi essere caricati direttamente su un gel di agarosio per elettroforesi, caricando otto microlitri per ogni reazione PCR in una corsia separata. Non è necessario aggiungere buffer e colorante prima del caricamento dei campioni poiché sono già inclusi nei tubi di reazione.

Interrompere l'elettroforesi dopo che il colorante di corsa ha migrato da 2,5 a tre centimetri. I risultati rappresentativi della rilevazione di micoplasmi mediante PCR sono mostrati in questa immagine di una corsia di gel aros. Il numero due è il controllo negativo, che dovrebbe mostrare una banda a circa 481 paia di basi.

L'assenza della banda del controllo negativo a 481 paia di basi è un buon indicatore del fatto che il TAC utilizzato non era sufficientemente sensibile. I campioni positivi per micoplasmi mostreranno bande nell'intervallo di 270 più o meno otto paia di basi, come mostrato nelle corsie da tre a sei. La banda sarà intensa nei campioni altamente contaminati e debole in quelli leggermente contaminati.

Tutti i campioni contengono un controllo negativo interno per dimostrare che la PCR è avvenuta come previsto. È normale osservare l'assenza del controllo interno in campioni altamente contaminati. L'assenza di una banda sia nel range positivo che in quello negativo, come mostrato nella corsia sette, è un buon indicatore del fatto che i campioni sono inibiti.

Se il campione è inibito. Gli inibitori della PCR possono essere rimossi eseguendo un'estrazione del DNA. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire tutti i passaggi necessari indicati nella procedura del kit, nonché di come interpretare i risultati e risolvere i problemi quando necessario.