Name: Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Impara a ricostituire il complesso proteico GR•Hsp90 in vitro per studiare il legame del ligando nel recettore dei glucocorticoidi. Questo metodo biochimico permette di analizzare i requisiti dei cofattori e gli effetti di composti esogeni.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concedere GM086822, Hope Heart Institute di base Scienze premio, e il MJ Murdock Charitable Fiducia Science Program College di ricerca. Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi immagine sono stati generosamente forniti da Bio-Rad.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi dell&#39;immagine sono stati forniti da Bio-Rad.

Il test di cui sopra può essere adattato per testare una miriade di malattie che interessano l&#39;azione chaperone della macchina chaperone hsp90/hsp70-based così come vincolanti GR steroidi. Si tratta di una modifica dei metodi precedentemente segnalato 4,8,9,17 ed è progettato per sfruttare i recenti progressi nella tecnologia elettroforesi ed essere accessibili a una comunità di ricerca più ampio. Cofattori aggiuntivi o proteine ​​di interesse possono essere aggiunti alla miscela GR • hsp90 ricostituzione...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> SF9 cellule di insetto </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> per l&#39;espressione del baculovirus ricombinante GR del mouse </td></tr><tr><td> L929 cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> endogeno del mouse GR citosol preparazione (in alternativa a espressione baculovirus) </td></tr><tr><td> FiGR ibridomi cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> per la preparazione di ascite contenente anti-GR anticorpo monoclonale (in alternativa a purificati BuGR2 anticorpi) </td></tr><tr><td> Completa mini-inibitore della proteasi, EDTA-free </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> proteina A-Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> lisato di reticolociti di coniglio </td><td> Ettari verde (Oregon, WI) </td><td></td><td> ricca fonte di macchinari endogena chaperone hsp90/hsp70 </td></tr><tr><td> creatina fosfochinasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> per la ATP-rigenerante sistema </td></tr><tr><td> fosfocreatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> per la ATP-rigenerante sistema </td></tr><tr><td> anti-GR anticorpo monoclonale di topo (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> utilizzati per GR immunoadsorbimento e anticorpi come primario in western blotting </td></tr><tr><td> anti-Hsp90 anticorpo monoclonale di topo (AC88) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> utilizzate come anticorpo primario in western blotting </td></tr><tr><td> anti-hsp70 anticorpo monoclonale di topo (N27F3-4) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> utilizzate come anticorpo primario in western blotting </td></tr><tr><td> IgG dal siero di topo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> usato come anticorpo non immune per il controllo negativo di immunoadsorbimento </td></tr><tr><td> anti-topo IgG-perossidasi coniugato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> usato come anticorpo secondario in western blotting </td></tr><tr><td> Experion elettroforesi microfluidica sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternativa ai tradizionali SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] desametasone </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> seguire le precauzioni di sicurezza </td></tr></tbody></table>

ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • complessi proteina hsp90 e la riattivazione del ligand binding

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 è una proteina essenziale ed estremamente abbondante chaperone molecolare che è stato trovato per regolare più di 150 proteine ​​eucariotiche di segnalazione, inclusi i fattori di trascrizione (es. recettori nucleari, p53) e di proteine ​​chinasi (es. Src, Raf, Akt chinasi) coinvolto nel ciclismo cellulare, tumorigenesi, l&#39;apoptosi, e più eucarioti 1,2 vie di segnalazione. Di questi molti &#39;cliente&#39; per le proteine ​​Hsp90, l&#39;assemblea dei recettori steroidei • hsp90 complessi è la miglior definito (Figura 1). Vi presentiamo qui un recettore glucocorticoide adattabile (GR) immunoprecipitazione e analisi in vitro GR • hsp90 metodo di ricostituzione che possono essere facilmente utilizzati per sondare eucariotiche hsp90 attività funzionale, hsp90-mediata ligando del recettore leganti gli steroidi, e molecolari requisiti cofattore accompagnatore. Per esempio, questo test può essere usato per testare hsp90 requisiti cofattore e gli effetti dell&#39;aggiunta di composti esogeni al processo di ricostituzione. Il GR è un sistema particolarmente utile per lo studio hsp90 perché il recettore deve essere associata a hsp90 di avere un legame aperto ligando fessura che sia accessibile a steroidi 3. Endogeno, GR unliganded è presente nel citoplasma delle cellule di mammifero noncovalently legato a hsp90. Come si trova nel GR endogeno • hsp90 heterocomplex, il legame con il ligando GR fessura è aperta e capace di steroidi vincolanti. Se hsp90 dissocia dalla GR o se la sua funzione è inibita, il recettore non è in grado di legare steroidi e richiede la ricostituzione del GR • hsp90 heterocomplex prima di steroidi attività di legame viene ripristinato 4. GR possono essere immunoprecipitato dal citoplasma delle cellule utilizzando un anticorpo monoclonale, e proteine ​​come hsp90 complessato al GR possono essere analizzati mediante western blot. Steroidi attività di legame della GR immunoprecipitato può essere determinato tramite l&#39;incubazione del immunopellet con [3 H] steroidi. Precedenti esperimenti hanno dimostrato hsp90-mediata apertura del legame con il ligando GR leporino richiede hsp70, un chaperone molecolare secondo anche essenziale per la vitalità delle cellule eucariotiche. Attività biochimica di Hsp90 e hsp70 sono catalizzate da co-chaperone Hop proteine, hsp40 e P23 5. Un macchinario chaperone multiproteici contenenti hsp90, hsp70, Hop, e hsp40 sono endogenamente presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche, e lisato di reticolociti fornisce una chaperone ricca fonte di proteine ​​6. Nel metodo presentato, GR è immunoadsorbed dal citoplasma cellulare e spogliato della macchina endogeno chaperone hsp90/hsp70 utilizzando condizioni di sale mite. Il GR sale così estratto è poi incubato con lisato di reticolociti, ATP, e K +, che comporta la ricostituzione della GR • hsp90 heterocomplex e riattivazione di steroidi attività di legame 7. Questo metodo può essere utilizzato per verificare gli effetti di cofattori chaperone diverse, nuove proteine ​​e sperimentali inibitori Hsp90 o GR al fine di determinare la loro importanza funzionale hsp90-mediata steroidi 8-11 vincolanti.

Un<em&gt; In vitro</emMetodo&gt; per la preparazione funzionale del recettore dei glucocorticoidi (GR) • hsp90 complessi proteici da proteine ​​purificate e lisati cellulari è descritto. Il metodo utilizza immunoadsorbimento ricombinante GR seguita da sale-stripping e di ricostituzione delle proteine ​​complesse. L&#39;importanza di cofattori e le condizioni di buffer sono discussi, così come le applicazioni potenziale metodo.

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

Hsp90 è una proteina chaperone molecolare essenziale e altamente abbondante, che risulta regolare più di 150 proteine di segnalazione eucariotiche, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricostruire biochimicamente un complesso proteico del recettore steroideo HSB 90 e riattivare l'attività di legame del ligando al recettore steroideo, che può essere utilizzata per verificare i requisiti dei cofattori di HSB 90 e gli effetti dell'aggiunta di composti esogeni al processo di ricostruzione. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un citosol cellulare contenente recettori glucocorticoidi funzionali. Successivamente, il recettore GR proveniente dal citosol cellulare viene immunoassorbito ed endogeno.L'HSP 90 viene dissociata. Successivamente, il complesso etero di GR e HSP 90 viene riconstituito utilizzando una fonte esogena di HSP 90 e altre proteine chaperone e cofattori. Infine, i complessi proteici riconstituiti e l'attività di legame del ligando vengono analizzati; in particolare, metodi come elettroforesi su SDS-PAGE, immunoblotting e saggi di legame con ligandi radioattivi vengono utilizzati per dimostrare la formazione del complesso etero di GR e HSP 90 e l'attività di legame degli steroidi.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle chaperone molecolari HSP 90, come ad esempio quali chaperone cofattori e chaperone COS siano necessarie per facilitare l'attività funzionale dell'HSP 90. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ripiegamento proteico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo sviluppo di composti guida dipendenti dall'HSP 90 e l'analisi delle vie di segnalazione intracellulare che richiedono l'HSP 90. A dimostrare la procedura saranno Hannah Franklin e Nathan, due studenti recentemente laureati del mio laboratorio. Per isolare il recettore del glucocorticolo funzionale, o GR, coltivare cellule di fibroblasti murini L 9 29 oppure cellule SF nine infettate con virus ricombinante GR bao, in fase di crescita esponenziale. Centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Il pellet risultante dovrebbe avere un volume compreso tra uno e cinque millilitri. Lavare il pellet cellulare tre volte con 15 millilitri di soluzione salina tamponata di Hank. Preparare 1,5 volumi di buffer di omogeneizzazione contenente buffer HEM, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) uno millimolare e tre compresse complete mini di inibitore della proteasi ridotte in polvere mediante 50 colpi di mortaio.L'omogenizzatore ha rotto le cellule; eseguire il passaggio sul ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine. Ultracentrifugare l'omogenato a 100.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aliquotare il soprannatante contenente il citosol in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro in aliquote da 500 microlitri ciascuna e conservare a meno 20 gradi Celsius.Per preparare una miscela contenente un anticorpo monoclonale IgG prodotto contro il recettore specifico GR, combinare 100 microlitri di citosol GR scongelato, 200 microlitri di tampone TEGM, 100 microlitri di una sospensione al 20% di proteina aserica o PAS e cinque microgrammi di un anticorpo monoclonale IgG anti-G, come ad esempio bugger due. A causa delle dimensioni relativamente grandi delle perle PAS.Utilizzare una punta di pipetta tagliata da 200 µL per trasferire il PAS dalla sospensione al 20% ai tubi del campione. Posizionare i campioni su una ruota rotante verticale e incubare per almeno due ore con rotazione costante. Successivamente, rimuovere le proteine non legate dal pellet di PAS con anticorpo centrifugando i campioni in una centrifuga refrigerata per un minuto.A 10.000 G, lavare il pellet due volte aggiungendo un millilitro di tampone TEGM, vortexando, quindi centrifugando. Rimuovere l'ultimo lavaggio utilizzando una punta pipetta P 200 staccata per dissociare l'HSB 90 endogeno dal pellet immuno del recettore glucocorticoideo e aggiungere 355 microlitri di tampone TEG e 45 microlitri di cloruro di sodio 5 M all'anticorpo. Pellet PAS precedentemente preparato.Posizionare i campioni su una ruota verticale rotante e incubare per un'ora e mezza con rotazione costante. Rimuovere le proteine non legate dal pellet immuno centrifugando per un minuto a 10.000 G. Lavare i pellet una volta con un millilitro di tampone TEG e una volta con un millilitro di 10 millimoli di heaps. Tampone pH 7,4 Utilizzando una punta pipetta P 200 staccata, rimuovere il lavaggio, avendo cura di non disturbare il pellet.Per ricostituire il complesso etero GR HSB 90, aggiungere al pellet una miscela contenente 50 microlitri di una fonte di chaperoni molecolari, come un lisato di reticolociti di coniglio, e cinque microlitri di un sistema rigeneratore di ATP. Questo passaggio successivo è fondamentale per garantire un'adeguata miscelazione del pellet e della soluzione di ricostituzione. Incubare i campioni in un bagno termostatato a 30 gradi Celsius per esattamente 20 minuti.Battere leggermente sui tubi ogni uno o due minuti per disturbare delicatamente il pellet e mescolare la soluzione di ricostituzione. Aggiungere un millilitro di tampone TEGM, vortexare e centrifugare a 10.000 G per un minuto. Rimuovere il soprannatante avendo cura di non disturbare il pellet.Ripetere il lavaggio altre due volte per identificare le proteine nel pellet ricostruito. Preparare i campioni per l'elettroforesi aggiungendo 50 microlitri di buffer campione per SDS-PAGE contenente beta-mercaptoetanolo. Vortexare i campioni, quindi incubarli per cinque minuti in un bagno di acqua bollente o in un blocco riscaldante elettronico a 100 gradi Celsius.Centrifugare i campioni a 10.000 G per un minuto. Utilizzare il soprannatante di questi campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE o microfluidica seguita da western blot. L'uso di una punta rigata P200 per caricare il soprannatante ridurrà il rischio di aspirazione accidentale del pellet.Il passo successivo consiste nel sottoporre il complesso proteico GR-HSP90 a un saggio per l'attività di legame agli steroidi. Utilizzando uno steroide triziato, iniziare aggiungendolo al pellet immunitario ricostituito: 47,5 microlitri di buffer HEM e 2,5 microlitri di desametasone triziato a due micromoli.Mescolare delicatamente il pellet avendo cura di ridurre al minimo la quantità di campione che aderisce alle pareti del tubo da microcentrifuga. Incubare il campione tutta la notte senza disturbarlo, su ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tampone TEGM, mescolare delicatamente e centrifugare a 10.000 ×g per un minuto.Eliminare il soprannatante con attenzione. Esso contiene lo steroide triziato non legato; ripetere per un totale di tre lavaggi con buffer TEGM. Rimuovere tutto il soprannatante al termine dell'ultimo lavaggio.Utilizzando una punta pipetta P 200 a crimpare, sospendere i pellet immuno lavati in 200 microlitri di tampone TEGM e trasferire in 10 millilitri. Vial per scintillazione.Aggiungere 4,8 millilitri di cocktail di scintillazione ai vial e vortexare. Infine, eseguire la spettrometria a scintillazione liquida; dati rappresentativi di elettroforesi SDS-PAGE e western blot sono mostrati qui in questo gel colorato con kumasi. Il complesso eterodimerico GR HSB 90 endogeno viene immunoadsorbito dal citosol cellulare utilizzando anticorpi anti-GR e le singole proteine che si co-adsorbono con il GR vengono visualizzate e mostrate.Di seguito sono riportati i dati di elettroforesi microfluidica Experian che rappresentano complessi eterodimerici GR HSP 90 ricostruiti. La specificità dell'immunoassorbimento del GR è confermata sostituendo l'anticorpo anti-GR utilizzato per l'immunoassorbimento con un anticorpo non immune, anche quando vengono impiegate quantità eccessive. Nessun GR né chaperoni molecolari vengono immunoprecipitati.Allo stesso modo, è possibile confermare la dissociazione della HSP 90 e di altre proteine chaperone dal GR depurato con sale mediante analisi western blot dei pellet immuno depurati e ricostituiti. La catena pesante dell'anticorpo immunoadsorbente è rilevabile sia con colorazione al Kumasi sia mediante western blot, e conferma che pellet immuno di dimensioni equivalenti vengono visualizzati in ciascuna corsia. Di seguito vengono presentati dati rappresentativi dell'attività di legame agli steroidi del GR ottenuto mediante immunoadsorbimento, utilizzando lisati di reticolociti o proteine purificate.L'attività di legame degli steroidi del complesso etero GR HSB 90 ricostituito raggiunge tipicamente il 75-100% del livello di attività di legame endogeno di GR HSB 90. Analogamente ai dati di elettroforesi, un anticorpo non immune può essere utilizzato al posto dell'anticorpo anti-GR come controllo negativo e come misura del legame non specifico dello steroide triziato. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'elettroforesi su gel bidimensionale possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quale impatto hanno le modifiche post-traduzionali di HSP 90 sul processo di ricostituzione del complesso etero e sul legame dello steroide. Saggi di ricostituzione, come quelli descritti in questo caso, hanno permesso ai ricercatori di esplorare il significato funzionale del sistema di chaperoni multiproteico basato su HSP 90 e HSP 70 e il suo assemblaggio progressivo, utilizzando il recettore per i glucocorticoidi come proteina cliente modello per HSP 90.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare complessi proteici funzionali del recettore dei glucocorticoidi HSP 90 a partire da proteine purificate in lisati cellulari. I passaggi utilizzati includono la preparazione del lisato cellulare contenente il recettore GR, l'assorbimento immunitario del recettore, la rimozione con sale dei proteine endogene e la ricostruzione del complesso eteromero mediante HSP 90 esogeno, cofattori HSP 70 e co-chaperine.

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In questo video, descriviamo un saggio di legame competitivo basato sulla citometria a flusso per rilevare le interazioni tra il recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) e il suo ligando naturale marcato in fluorescenza CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in presenza di una piccola molecola mirata a CXCR4. L'incubazione di cellule che esprimono CXCR4 con concentrazioni più basse di piccole molecole consente in una certa misura il legame CXCR4-CXCL12, che diminuisce progressivamente con un aumento...

Saggio di legame competitivo per identificare i composti che interrompono le interazioni recettore-ligando

Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

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Ketoconazolo lega e antagonizza Pregnane X Receptor (PXR) attivazione. Di lievito di alta schermi di throughput di mutanti PXR definiscono una regione unica per l'associazione ketoconazolo. Questo metodo genetico a base di lievito scopre interazioni recettore nucleare nuovi con leganti che associano con siti di legame di superficie.

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Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra il recettore delle cellule T e gli antigeni tumorali, presentati dagli antigeni dei leucociti umani, governa la funzionalità delle cellule T; questi metodi includono la produzione di proteine, la cristallografia a raggi X, la biofisica e gli esperimenti funzionali sulle cellule T.

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

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Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

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Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

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