Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricostruire biochimicamente un complesso proteico del recettore steroideo HSB 90 e riattivare l'attività di legame del ligando al recettore steroideo, che può essere utilizzata per verificare i requisiti dei cofattori di HSB 90 e gli effetti dell'aggiunta di composti esogeni al processo di ricostruzione. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un citosol cellulare contenente recettori glucocorticoidi funzionali. Successivamente, il recettore GR proveniente dal citosol cellulare viene immunoassorbito ed endogeno.

L'HSP 90 viene dissociata. Successivamente, il complesso etero di GR e HSP 90 viene riconstituito utilizzando una fonte esogena di HSP 90 e altre proteine chaperone e cofattori. Infine, i complessi proteici riconstituiti e l'attività di legame del ligando vengono analizzati; in particolare, metodi come elettroforesi su SDS-PAGE, immunoblotting e saggi di legame con ligandi radioattivi vengono utilizzati per dimostrare la formazione del complesso etero di GR e HSP 90 e l'attività di legame degli steroidi.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle chaperone molecolari HSP 90, come ad esempio quali chaperone cofattori e chaperone COS siano necessarie per facilitare l'attività funzionale dell'HSP 90. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ripiegamento proteico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo sviluppo di composti guida dipendenti dall'HSP 90 e l'analisi delle vie di segnalazione intracellulare che richiedono l'HSP 90. A dimostrare la procedura saranno Hannah Franklin e Nathan, due studenti recentemente laureati del mio laboratorio. Per isolare il recettore del glucocorticolo funzionale, o GR, coltivare cellule di fibroblasti murini L 9 29 oppure cellule SF nine infettate con virus ricombinante GR bao, in fase di crescita esponenziale. Centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Il pellet risultante dovrebbe avere un volume compreso tra uno e cinque millilitri. Lavare il pellet cellulare tre volte con 15 millilitri di soluzione salina tamponata di Hank. Preparare 1,5 volumi di buffer di omogeneizzazione contenente buffer HEM, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) uno millimolare e tre compresse complete mini di inibitore della proteasi ridotte in polvere mediante 50 colpi di mortaio.

L'omogenizzatore ha rotto le cellule; eseguire il passaggio sul ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine. Ultracentrifugare l'omogenato a 100.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aliquotare il soprannatante contenente il citosol in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro in aliquote da 500 microlitri ciascuna e conservare a meno 20 gradi Celsius.

Per preparare una miscela contenente un anticorpo monoclonale IgG prodotto contro il recettore specifico GR, combinare 100 microlitri di citosol GR scongelato, 200 microlitri di tampone TEGM, 100 microlitri di una sospensione al 20% di proteina aserica o PAS e cinque microgrammi di un anticorpo monoclonale IgG anti-G, come ad esempio bugger due. A causa delle dimensioni relativamente grandi delle perle PAS.

Utilizzare una punta di pipetta tagliata da 200 µL per trasferire il PAS dalla sospensione al 20% ai tubi del campione. Posizionare i campioni su una ruota rotante verticale e incubare per almeno due ore con rotazione costante. Successivamente, rimuovere le proteine non legate dal pellet di PAS con anticorpo centrifugando i campioni in una centrifuga refrigerata per un minuto.

A 10.000 G, lavare il pellet due volte aggiungendo un millilitro di tampone TEGM, vortexando, quindi centrifugando. Rimuovere l'ultimo lavaggio utilizzando una punta pipetta P 200 staccata per dissociare l'HSB 90 endogeno dal pellet immuno del recettore glucocorticoideo e aggiungere 355 microlitri di tampone TEG e 45 microlitri di cloruro di sodio 5 M all'anticorpo. Pellet PAS precedentemente preparato.

Posizionare i campioni su una ruota verticale rotante e incubare per un'ora e mezza con rotazione costante. Rimuovere le proteine non legate dal pellet immuno centrifugando per un minuto a 10.000 G. Lavare i pellet una volta con un millilitro di tampone TEG e una volta con un millilitro di 10 millimoli di heaps. Tampone pH 7,4 Utilizzando una punta pipetta P 200 staccata, rimuovere il lavaggio, avendo cura di non disturbare il pellet.

Per ricostituire il complesso etero GR HSB 90, aggiungere al pellet una miscela contenente 50 microlitri di una fonte di chaperoni molecolari, come un lisato di reticolociti di coniglio, e cinque microlitri di un sistema rigeneratore di ATP. Questo passaggio successivo è fondamentale per garantire un'adeguata miscelazione del pellet e della soluzione di ricostituzione. Incubare i campioni in un bagno termostatato a 30 gradi Celsius per esattamente 20 minuti.

Battere leggermente sui tubi ogni uno o due minuti per disturbare delicatamente il pellet e mescolare la soluzione di ricostituzione. Aggiungere un millilitro di tampone TEGM, vortexare e centrifugare a 10.000 G per un minuto. Rimuovere il soprannatante avendo cura di non disturbare il pellet.

Ripetere il lavaggio altre due volte per identificare le proteine nel pellet ricostruito. Preparare i campioni per l'elettroforesi aggiungendo 50 microlitri di buffer campione per SDS-PAGE contenente beta-mercaptoetanolo. Vortexare i campioni, quindi incubarli per cinque minuti in un bagno di acqua bollente o in un blocco riscaldante elettronico a 100 gradi Celsius.

Centrifugare i campioni a 10.000 G per un minuto. Utilizzare il soprannatante di questi campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE o microfluidica seguita da western blot. L'uso di una punta rigata P200 per caricare il soprannatante ridurrà il rischio di aspirazione accidentale del pellet.

Il passo successivo consiste nel sottoporre il complesso proteico GR-HSP90 a un saggio per l'attività di legame agli steroidi. Utilizzando uno steroide triziato, iniziare aggiungendolo al pellet immunitario ricostituito: 47,5 microlitri di buffer HEM e 2,5 microlitri di desametasone triziato a due micromoli.

Mescolare delicatamente il pellet avendo cura di ridurre al minimo la quantità di campione che aderisce alle pareti del tubo da microcentrifuga. Incubare il campione tutta la notte senza disturbarlo, su ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tampone TEGM, mescolare delicatamente e centrifugare a 10.000 ×g per un minuto.

Eliminare il soprannatante con attenzione. Esso contiene lo steroide triziato non legato; ripetere per un totale di tre lavaggi con buffer TEGM. Rimuovere tutto il soprannatante al termine dell'ultimo lavaggio.

Utilizzando una punta pipetta P 200 a crimpare, sospendere i pellet immuno lavati in 200 microlitri di tampone TEGM e trasferire in 10 millilitri. Vial per scintillazione.

Aggiungere 4,8 millilitri di cocktail di scintillazione ai vial e vortexare. Infine, eseguire la spettrometria a scintillazione liquida; dati rappresentativi di elettroforesi SDS-PAGE e western blot sono mostrati qui in questo gel colorato con kumasi. Il complesso eterodimerico GR HSB 90 endogeno viene immunoadsorbito dal citosol cellulare utilizzando anticorpi anti-GR e le singole proteine che si co-adsorbono con il GR vengono visualizzate e mostrate.

Di seguito sono riportati i dati di elettroforesi microfluidica Experian che rappresentano complessi eterodimerici GR HSP 90 ricostruiti. La specificità dell'immunoassorbimento del GR è confermata sostituendo l'anticorpo anti-GR utilizzato per l'immunoassorbimento con un anticorpo non immune, anche quando vengono impiegate quantità eccessive. Nessun GR né chaperoni molecolari vengono immunoprecipitati.

Allo stesso modo, è possibile confermare la dissociazione della HSP 90 e di altre proteine chaperone dal GR depurato con sale mediante analisi western blot dei pellet immuno depurati e ricostituiti. La catena pesante dell'anticorpo immunoadsorbente è rilevabile sia con colorazione al Kumasi sia mediante western blot, e conferma che pellet immuno di dimensioni equivalenti vengono visualizzati in ciascuna corsia. Di seguito vengono presentati dati rappresentativi dell'attività di legame agli steroidi del GR ottenuto mediante immunoadsorbimento, utilizzando lisati di reticolociti o proteine purificate.

L'attività di legame degli steroidi del complesso etero GR HSB 90 ricostituito raggiunge tipicamente il 75-100% del livello di attività di legame endogeno di GR HSB 90. Analogamente ai dati di elettroforesi, un anticorpo non immune può essere utilizzato al posto dell'anticorpo anti-GR come controllo negativo e come misura del legame non specifico dello steroide triziato. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'elettroforesi su gel bidimensionale possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quale impatto hanno le modifiche post-traduzionali di HSP 90 sul processo di ricostituzione del complesso etero e sul legame dello steroide. Saggi di ricostituzione, come quelli descritti in questo caso, hanno permesso ai ricercatori di esplorare il significato funzionale del sistema di chaperoni multiproteico basato su HSP 90 e HSP 70 e il suo assemblaggio progressivo, utilizzando il recettore per i glucocorticoidi come proteina cliente modello per HSP 90.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare complessi proteici funzionali del recettore dei glucocorticoidi HSP 90 a partire da proteine purificate in lisati cellulari. I passaggi utilizzati includono la preparazione del lisato cellulare contenente il recettore GR, l'assorbimento immunitario del recettore, la rimozione con sale dei proteine endogene e la ricostruzione del complesso eteromero mediante HSP 90 esogeno, cofattori HSP 70 e co-chaperine.