Name: Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Impara a ricostituire il complesso proteico GR•Hsp90 in vitro per studiare il legame del ligando nel recettore dei glucocorticoidi. Questo metodo biochimico permette di analizzare i requisiti dei cofattori e gli effetti di composti esogeni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concedere GM086822, Hope Heart Institute di base Scienze premio, e il MJ Murdock Charitable Fiducia Science Program College di ricerca. Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi immagine sono stati generosamente forniti da Bio-Rad.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi dell&#39;immagine sono stati forniti da Bio-Rad.

Il test di cui sopra può essere adattato per testare una miriade di malattie che interessano l&#39;azione chaperone della macchina chaperone hsp90/hsp70-based così come vincolanti GR steroidi. Si tratta di una modifica dei metodi precedentemente segnalato 4,8,9,17 ed è progettato per sfruttare i recenti progressi nella tecnologia elettroforesi ed essere accessibili a una comunità di ricerca più ampio. Cofattori aggiuntivi o proteine ​​di interesse possono essere aggiunti alla miscela GR • hsp90 ricostituzione...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> SF9 cellule di insetto </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> per l&#39;espressione del baculovirus ricombinante GR del mouse </td></tr><tr><td> L929 cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> endogeno del mouse GR citosol preparazione (in alternativa a espressione baculovirus) </td></tr><tr><td> FiGR ibridomi cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> per la preparazione di ascite contenente anti-GR anticorpo monoclonale (in alternativa a purificati BuGR2 anticorpi) </td></tr><tr><td> Completa mini-inibitore della proteasi, EDTA-free </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> proteina A-Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> lisato di reticolociti di coniglio </td><td> Ettari verde (Oregon, WI) </td><td></td><td> ricca fonte di macchinari endogena chaperone hsp90/hsp70 </td></tr><tr><td> creatina fosfochinasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> per la ATP-rigenerante sistema </td></tr><tr><td> fosfocreatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> per la ATP-rigenerante sistema </td></tr><tr><td> anti-GR anticorpo monoclonale di topo (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> utilizzati per GR immunoadsorbimento e anticorpi come primario in western blotting </td></tr><tr><td> anti-Hsp90 anticorpo monoclonale di topo (AC88) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> utilizzate come anticorpo primario in western blotting </td></tr><tr><td> anti-hsp70 anticorpo monoclonale di topo (N27F3-4) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> utilizzate come anticorpo primario in western blotting </td></tr><tr><td> IgG dal siero di topo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> usato come anticorpo non immune per il controllo negativo di immunoadsorbimento </td></tr><tr><td> anti-topo IgG-perossidasi coniugato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> usato come anticorpo secondario in western blotting </td></tr><tr><td> Experion elettroforesi microfluidica sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternativa ai tradizionali SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] desametasone </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> seguire le precauzioni di sicurezza </td></tr></tbody></table>

ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • complessi proteina hsp90 e la riattivazione del ligand binding

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 è una proteina essenziale ed estremamente abbondante chaperone molecolare che è stato trovato per regolare più di 150 proteine ​​eucariotiche di segnalazione, inclusi i fattori di trascrizione (es. recettori nucleari, p53) e di proteine ​​chinasi (es. Src, Raf, Akt chinasi) coinvolto nel ciclismo cellulare, tumorigenesi, l&#39;apoptosi, e più eucarioti 1,2 vie di segnalazione. Di questi molti &#39;cliente&#39; per le proteine ​​Hsp90, l&#39;assemblea dei recettori steroidei • hsp90 complessi è la miglior definito (Figura 1). Vi presentiamo qui un recettore glucocorticoide adattabile (GR) immunoprecipitazione e analisi in vitro GR • hsp90 metodo di ricostituzione che possono essere facilmente utilizzati per sondare eucariotiche hsp90 attività funzionale, hsp90-mediata ligando del recettore leganti gli steroidi, e molecolari requisiti cofattore accompagnatore. Per esempio, questo test può essere usato per testare hsp90 requisiti cofattore e gli effetti dell&#39;aggiunta di composti esogeni al processo di ricostituzione. Il GR è un sistema particolarmente utile per lo studio hsp90 perché il recettore deve essere associata a hsp90 di avere un legame aperto ligando fessura che sia accessibile a steroidi 3. Endogeno, GR unliganded è presente nel citoplasma delle cellule di mammifero noncovalently legato a hsp90. Come si trova nel GR endogeno • hsp90 heterocomplex, il legame con il ligando GR fessura è aperta e capace di steroidi vincolanti. Se hsp90 dissocia dalla GR o se la sua funzione è inibita, il recettore non è in grado di legare steroidi e richiede la ricostituzione del GR • hsp90 heterocomplex prima di steroidi attività di legame viene ripristinato 4. GR possono essere immunoprecipitato dal citoplasma delle cellule utilizzando un anticorpo monoclonale, e proteine ​​come hsp90 complessato al GR possono essere analizzati mediante western blot. Steroidi attività di legame della GR immunoprecipitato può essere determinato tramite l&#39;incubazione del immunopellet con [3 H] steroidi. Precedenti esperimenti hanno dimostrato hsp90-mediata apertura del legame con il ligando GR leporino richiede hsp70, un chaperone molecolare secondo anche essenziale per la vitalità delle cellule eucariotiche. Attività biochimica di Hsp90 e hsp70 sono catalizzate da co-chaperone Hop proteine, hsp40 e P23 5. Un macchinario chaperone multiproteici contenenti hsp90, hsp70, Hop, e hsp40 sono endogenamente presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche, e lisato di reticolociti fornisce una chaperone ricca fonte di proteine ​​6. Nel metodo presentato, GR è immunoadsorbed dal citoplasma cellulare e spogliato della macchina endogeno chaperone hsp90/hsp70 utilizzando condizioni di sale mite. Il GR sale così estratto è poi incubato con lisato di reticolociti, ATP, e K +, che comporta la ricostituzione della GR • hsp90 heterocomplex e riattivazione di steroidi attività di legame 7. Questo metodo può essere utilizzato per verificare gli effetti di cofattori chaperone diverse, nuove proteine ​​e sperimentali inibitori Hsp90 o GR al fine di determinare la loro importanza funzionale hsp90-mediata steroidi 8-11 vincolanti.

Un<em&gt; In vitro</emMetodo&gt; per la preparazione funzionale del recettore dei glucocorticoidi (GR) • hsp90 complessi proteici da proteine ​​purificate e lisati cellulari è descritto. Il metodo utilizza immunoadsorbimento ricombinante GR seguita da sale-stripping e di ricostituzione delle proteine ​​complesse. L&#39;importanza di cofattori e le condizioni di buffer sono discussi, così come le applicazioni potenziale metodo.

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

Hsp90 è una proteina chaperone molecolare essenziale e altamente abbondante, che risulta regolare più di 150 proteine di segnalazione eucariotiche, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricostruire biochimicamente un complesso proteico del recettore steroideo HSB 90 e riattivare l'attività di legame del ligando al recettore steroideo, che può essere utilizzata per verificare i requisiti dei cofattori di HSB 90 e gli effetti dell'aggiunta di composti esogeni al processo di ricostruzione. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un citosol cellulare contenente recettori glucocorticoidi funzionali. Successivamente, il recettore GR proveniente dal citosol cellulare viene immunoassorbito ed endogeno.L'HSP 90 viene dissociata. Successivamente, il complesso etero di GR e HSP 90 viene riconstituito utilizzando una fonte esogena di HSP 90 e altre proteine chaperone e cofattori. Infine, i complessi proteici riconstituiti e l'attività di legame del ligando vengono analizzati; in particolare, metodi come elettroforesi su SDS-PAGE, immunoblotting e saggi di legame con ligandi radioattivi vengono utilizzati per dimostrare la formazione del complesso etero di GR e HSP 90 e l'attività di legame degli steroidi.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle chaperone molecolari HSP 90, come

biochemical-reconstitution-steroid-receptorhsp90-protein-complexes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo video, descriviamo un saggio di legame competitivo basato sulla citometria a flusso per rilevare le interazioni tra il recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) e il suo ligando naturale marcato in fluorescenza CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in presenza di una piccola molecola mirata a CXCR4. L'incubazione di cellule che esprimono CXCR4 con concentrazioni più basse di piccole molecole consente in una certa misura il legame CXCR4-CXCL12, che diminuisce progressivamente con un aumento...

Saggio di legame competitivo per identificare i composti che interrompono le interazioni recettore-ligando

Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

Ketoconazolo lega e antagonizza Pregnane X Receptor (PXR) attivazione. Di lievito di alta schermi di throughput di mutanti PXR definiscono una regione unica per l'associazione ketoconazolo. Questo metodo genetico a base di lievito scopre interazioni recettore nucleare nuovi con leganti che associano con siti di legame di superficie.

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra il recettore delle cellule T e gli antigeni tumorali, presentati dagli antigeni dei leucociti umani, governa la funzionalità delle cellule T; questi metodi includono la produzione di proteine, la cristallografia a raggi X, la biofisica e gli esperimenti funzionali sulle cellule T.

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Un protocollo corto per la colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in gel di poliacrilammide è descritto senza l'utilizzo di solventi organici o acido acetico come nelle procedure di colorazione classica con CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

Impara a ricostituire il complesso proteico GR•Hsp90 in vitro per studiare il legame del ligando nel recettore dei glucocorticoidi. Questo metodo biochimico permette di analizzare i requisiti dei cofattori e gli effetti di composti esogeni.

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

Esplora altri video