Identificazione degli inibitori delle chinasi che modulano la risposta dei timociti a forti segnali TCR

Inizia con le cellule dei timociti dei topi in una piastra a più pozzetti. Aggiungere perline magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. A un sottoinsieme di pozzetti, aggiungere una concentrazione appropriata dell'inibitore della chinasi di prova. Incubare.

Gli anticorpi si legano ai recettori CD3 e CD28 della superficie cellulare sui timociti doppi positivi e li attivano, causando una sottoregolazione dei recettori delle cellule T, dei TCR e l'attivazione della proteina chinasi citosolica.

Queste protein chinasi attivano le vie di segnalazione a valle, portando ad un aumento dell'espressione di CD69 sulla superficie cellulare e all'attivazione della caspasi-3 citosolica. La caspasi-3 attivata scinde le proteine cellulari essenziali, avviando l'apoptosi dei timociti.

Nelle cellule trattate con l'inibitore della chinasi, gli inibitori bloccano le chinasi citosoliche, modulando l'espressione di CD69 e l'attivazione della caspasi-3.

Pipetta in un cocktail di anticorpi marcati con fluorofori che si lega ai co-recettori TCR, CD4 e CD8 e ai recettori CD69 dei timociti. Trattare i timociti con un tampone per fissarli e permeabilizzarli.

Incubare con un anticorpo anti-caspasi-3 marcato con fluoroforo che si lega alla caspasi-3 citosolica. Analizzare i timociti utilizzando la citometria a flusso.

I timociti doppi positivi di controllo esprimono i marcatori fluorescenti della superficie cellulare CD4, CD8 e CD69 e la caspasi-3 intracellulare e mostrano una sottoregolazione del TCR. Al contrario, i timociti trattati con inibitori mostrano livelli più bassi di CD69 fluorescente e caspasi-3.

Per iniziare il trattamento dei timociti con inibitori delle chinasi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 40 microlitri per pozzetto di timociti a una piastra di piccolo volume. Metti il piatto sul ghiaccio. Quindi, pipettare una parte di inibitori delle chinasi, DMSO e desametasone e quattro parti del terreno RPMI completo in una piastra a 96 pozzetti.

Designare otto pozzetti della piastra di piccolo volume ai controlli non trattati, quattro pozzetti ai controlli positivi trattati con desametasone per la morte cellulare, aggiungendo il desametasone diluito alla concentrazione di 5 micromolari, e quattro pozzetti ai controlli trattati con veicolo aggiungendo 0,5 microlitri di DMSO diluito. Successivamente, dai pozzetti corrispondenti della piastra dell'inibitore, aggiungere 0,5 microlitri di ciascun inibitore diluito alla piastra a 96 pozzetti.

Per iniziare la stimolazione dei timociti, in primo luogo, assicurarsi che le perle anti-CD3 e CD28 siano risospese uniformemente. Quindi, lavare 1 millilitro di perline con 2 millilitri di tampone PBS. Mettere il tubo su un supporto magnetico per separare le perle dal surnatante e aspirare la soluzione. Quindi, risospendere le perle in 1 millilitro del mezzo RPMI completo.

Aggiungere 10 microlitri per pozzetto della sospensione di perline a ciascun campione trattato con inibitore, ai quattro campioni trattati con DMSO e a quattro degli 8 campioni non trattati. Aggiungere 10 microlitri di RPMI completo ai restanti quattro pozzetti non trattati.

Utilizzare uno shaker orbitale per micropiastre per agitare delicatamente la piastra. Successivamente, incubare i timociti in un ambiente a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 17-20 ore o durante la notte.

Adescare una lavatrice automatica per piastre a flusso laminare, prima con 150 millilitri di soluzione di etanolo Tween, poi con acqua deionizzata integrata con l'1% di Tween-20 e infine con tampone di lavaggio FACS. Al termine dell'incubazione, utilizzando il sistema di lavaggio delle piastre, lavare la piastra con il tampone di lavaggio FACS utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte. Ogni lavaggio aggiunge e rimuove 55 microlitri di tampone di lavaggio mediante flusso laminare, con conseguente diluizione esponenziale dei reagenti nei pozzetti.

Per colorare gli antigeni superficiali, in primo luogo, diluire un'unità di volume di anticorpi anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD69 in 100 unità di volume del tampone di lavaggio FACS. Quindi, risospendere le cellule in 25 microlitri della miscela di anticorpi coloranti. Utilizzare uno shaker orbitale per micropiastre per agitare delicatamente la piastra, quindi lasciare la piastra sul ghiaccio per 30 minuti.

Per fissare le celle, per prima cosa, lavare la piastra con 55 microlitri di tampone di lavaggio FACS utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte come descritto in precedenza. Quindi, aggiungere 50 microlitri di tampone di fissazione e permeabilizzazione a ciascun pozzetto. Mescolare bene e incubare la piastra con ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, preparare un tampone 1x perm/lavaggio diluendo 25 millilitri del brodo 10x fornito in 225 millilitri di acqua ultrapura.

Adescare la lavapiatti con 1x tampone e lavare la piastra con 55 microlitri di 1x tampone utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte come descritto in precedenza. Mescolare 1 millilitro di anticorpo anti-caspasi-3 con 2 millilitri di tampone 1x permanente e lavaggio. Aggiungere 25 microlitri per pozzetto della miscela alle celle fisse.

Utilizzare uno shaker orbitale per micropiastre per agitare delicatamente la piastra. Lasciare il piatto sul ghiaccio per un'ora. Al termine dell'incubazione, ripetere la fase di lavaggio, nove volte con la permanente 1x e il tampone di lavaggio. Quindi, aggiungere 25 microlitri di tampone di lavaggio FACS a tutti i pozzetti della piastra, pipettare su e giù alcune volte per mescolare la soluzione.

Infine, trasferire i campioni misti in provette per microtitolazione. Rabboccare le provette con il tampone di lavaggio FACS fino a un volume totale di 200 microlitri e procedere all'analisi della citometria a flusso.