Identificazione degli inibitori delle chinasi che modulano la risposta dei timociti a forti segnali TCR

Inizia con le cellule dei timociti dei topi in una piastra a più pozzetti. Aggiungere perline magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. A un sottoinsieme di pozzetti, aggiungere una concentrazione appropriata dell'inibitore della chinasi di prova. Incubare.

Gli anticorpi si legano ai recettori CD3 e CD28 della superficie cellulare sui timociti doppi positivi e li attivano, causando una sottoregolazione dei recettori delle cellule T, dei TCR e l'attivazione della proteina chinasi citosolica.

Queste protein chinasi attivano le vie di segnalazione a valle, portando ad un aumento dell'espressione di CD69 sulla superficie cellulare e all'attivazione della caspasi-3 citosolica. La caspasi-3 attivata scinde le proteine cellulari essenziali, avviando l'apoptosi dei timociti.

Nelle cellule trattate con l'inibitore della chinasi, gli inibitori bloccano le chinasi citosoliche, modulando l'espressione di CD69 e l'attivazione della caspasi-3.

Pipetta in un cocktail di anticorpi marcati con fluorofori che si lega ai co-recettori TCR, CD4 e CD8 e ai recettori CD69 dei timociti. Trattare i timociti con un tampone per fissarli e permeabilizzarli.

Incubare con un anticorpo anti-caspas