Attivazione di macrofagi derivati dal midollo osseo di topo in risposta agli anticorpi

In seguito all'esposizione ai patogeni, i macrofagi subiscono l'attivazione e rilasciano citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie, coordinando la risposta del sistema immunitario.

Per studiare l'attivazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo in vitro, trasferire una sospensione isolata di cellule di midollo osseo di topo in un pallone di coltura. Incubare brevemente.

Le cellule mesenchimali, i monociti e i macrofagi maturi aderiscono alla superficie del pallone mentre i progenitori ematopoietici rimangono in sospensione.

Raccogliere i terreni contenenti i progenitori ematopoietici e centrifugare. Trasferire le cellule risospese nel fattore stimolante le colonie di macrofagi, M-CSF, in un pallone di coltura.

L'M-CSF fa sì che la sottopopolazione progenitrice mieloide si differenzi in macrofagi, che appaiono ramificati e aderiscono al pallone.

Eliminare il terreno contenente cellule non aderenti. Aggiungere i terreni M-CSF e incubare. Una volta che i macrofagi raggiungono il loro stato di piena funzionalità, raccoglieli. Centrifuga.

Macrofagi a piastre risospesi in terreni M-CSF in pozzetti a piastre multipozzetto. Dopo l'adesione dei macrofagi ai pozzetti, aggiungere immunoglobuline policlonali umane e lipopolisaccaride batterico, LPS, una tossina.

Le immunoglobuline si legano a specifici recettori FCγ, mentre LPS si lega ai recettori Toll-like sui macrofagi. Questa co-stimolazione guida l'attivazione dei macrofagi antinfiammatori attraverso cascate di segnalazione a valle, causando il rilascio di alti livelli di citochine antinfiammatorie e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie.

Raccogliere i terreni contenenti citochine per ulteriori analisi per confermare l'attivazione dei macrofagi.

Fissa un topo euforino supino su una tavola di schiuma con gli arti distesi, quindi pulisci le gambe con etanolo al 70%. Successivamente, fai un taglio poco profondo di circa 2 millimetri per rimuovere la pelle e il pelo dalla superficie di ciascuna zampa posteriore. Quindi, seziona i tessuti per accedere alle tibie e ai femori.

Per rimuovere le tibie e i femori, tagliare l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie. Quindi, rimuovi quanto più tessuto muscolare possibile dalle ossa. Quindi, pulire le ossa con etanolo al 70% e lasciarlo evaporare per 1 minuto, quindi posizionare le ossa in una piastra a 6 pozzetti riempita con terreno di lavaggio delle ossa.

Nella piastra, tagliare 1 millimetro da entrambe le estremità dei femori in modo che le loro cavità interne siano esposte. Assicurati che un ago calibro 26 possa accedere alle cavità. Quindi, separa la tibia e il femore dall'articolazione del ginocchio. Quindi, inserire l'ago collegato a una siringa da 10 millilitri in una cavità ossea e raccogliere il midollo osseo.

Raggruppare il midollo osseo di tutte e 4 le ossa in una provetta conica da 50 millilitri con 5 millilitri di terreno di lavaggio osseo. Pipettare più volte il terreno e il midollo su e giù, oppure agitare a bassa velocità per disperdere delicatamente i grumi nella sospensione. I fili di midollo dovrebbero essere spezzati in piccole macchie di midollo lunghe meno di mezzo millimetro.

Quindi, rabboccare la provetta a 50 millilitri con il terreno di lavaggio osseo e trasferirla in un pallone di coltura tissutale di 75 centimetri quadrati. Incubare il midollo osseo per un'ora. Durante l'incubazione, le cellule mature aderiranno al pallone e i progenitori ematopoietici desiderati rimarranno in sospensione. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri e far girare le cellule in un pellet.

Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 millilitri di terreno di coltura MCSF. Quindi, regolare la densità delle celle a 500.000 per millilitro e caricare 30 millilitri in un nuovo pallone da 75 centimetri quadrati. Continuare a coltivare le cellule e nei giorni 4, 7 e 10, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificate utilizzando un microscopio a campo chiaro a contrasto di fase invertito.

Quando si controllano le cellule, scartare il terreno contenente le cellule non aderenti. Quindi, lavare una volta le cellule aderenti con IMDM e aggiungere nuovamente 30 millilitri di terreno di coltura MSCF fresco nel pallone. Il giorno 10, sostituire il terreno con 8 millilitri di tampone di dissociazione cellulare basato su EDTA privo di enzimi per raccogliere le cellule. Incubare brevemente le cellule, quindi raschiare delicatamente le cellule e verificare che siano state rilasciate utilizzando un microscopio.

Una volta che le cellule sono state rilasciate, trasferire il tampone con le cellule in una provetta conica da 50 millilitri, quindi sciacquare il pallone tre volte con 5 millilitri di IMDM per raccogliere più cellule. Raggruppare tutte le raccolte, centrifugarle e risospendere il pellet in 3 millilitri di MCSF. Ora, conta le cellule e regola la loro concentrazione a 1 milione per millilitro.

Quindi, piastra 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. L'intero piatto dovrebbe essere riempibile. Coltiva le cellule per circa un'ora fino a quando non sono aderenti. Quindi, stimolali con diverse concentrazioni di LPS o immunoglobuline per via endovenosa o entrambe, preparate in IMDM. Eseguire tutte le manipolazioni in doppio o triplicato e assicurarsi di mantenere i controlli non trattati, quindi incubare le cellule per 24 ore e analizzare i surnatanti.