JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:05 min. • July 8th, 2025
I macrofagi peritoneali, che risiedono nella cavità peritoneale, inghiottono i patogeni e secernono citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie per modulare la risposta immunitaria.
Per studiare l'attivazione in vivo dei macrofagi peritoneali, iniziare trattenendo il topo per minimizzarne il movimento. Prendi una miscela di lipopolisaccaridi, antigeni derivati da agenti patogeni e immunoglobuline per via endovenosa, e iniettali per via intraperitoneale.
Dopo l'iniezione, i lipopolisaccaridi si legano ai recettori di riconoscimento dei modelli dei macrofagi, innescando una risposta immunitaria e rilasciando citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-12.
Al contrario, le immunoglobuline interagiscono con i recettori Fc dei macrofagi, sottoregolando la risposta immunitaria sopprimendo la produzione di IL-12 e promuovendo il rilascio di citochine antinfiammatorie, tra cui IL-10. Questa co-stimolazione da parte di lipopolisaccaridi e immunoglobuline attiva i macrofagi peritoneali in macrofagi antinfiammatori.
Fissare il topo soppresso e praticare un'incisione longitudinale lungo la cavità addominale. Ritrarre la pelle dal muscolo addominale. Iniettare un tampone nella cavità peritoneale; agitare per rimuovere le cellule dalla cavità peritoneale.
Raccogliere il liquido peritoneale attivo contenente macrofagi.
Coltiva questi macrofagi attivati in un terreno contenente molecole co-stimolatorie: immunoglobuline e lipopolisaccaridi per consentire la produzione di citochine. Raccogliere il terreno esaurito e quantificare i livelli di citochine utilizzando un saggio di immunoassorbimento enzimatico.
Una concentrazione di IL-10 più elevata rispetto all'IL-12 conferma il successo dell'attivazione dei macrofagi antinfiammatori peritoneali.
Preparare una siringa da 1 millilitro con la quantità richiesta di immunoglobuline e LPS per via endovenosa e collegare un ago calibro 26. Per i controlli, utilizzare invece PBS e LPS.
Afferra il topo per la collottola mentre gli assicuri i quarti posteriori e la coda con una mano. Prendi di mira il quadrante inferiore destro dell'addome e inserisci l'ago con un angolo di 30-40 gradi con lo smusso rivolto verso l'alto e inseriscilo di circa 1,5 cm. Quindi, iniettare il bolo. Dopo un'ora, raccogliere i macrofagi peritoneali dopo l'eutanasia del topo.
In un cappuccio sterile, appuntare il topo soppresso a una tavola di gommapiuma con gli arti divaricati e sterilizzare l'addome con etanolo al 70%. Quindi, fai un'incisione superficiale di 2 millimetri lungo la linea mediana e tira via la pelle addominale. Evitare di forare la parete peritoneale.
Quindi, caricare completamente una siringa da 5 millilitri con PBS sterile a pH 7,4 e iniettare il topo utilizzando un ago calibro 25 o 27 nella parte superiore della cavità peritoneale da entrambi i lati verso la linea mediana con lo smusso dell'ago verso l'alto. Dopo aver estratto l'ago, massaggiare il peritoneo per 10 secondi per rimuovere le cellule.
Ora, reinserire l'ago nella cavità e raccogliere circa 3,75 millilitri di liquido di lavaggio. Trasferire il liquido di lavaggio in un tubo conico da 15 millilitri con ghiaccio. Ripetere l'iniezione, il massaggio e la raccolta del liquido di lavaggio altre tre volte e riunire tutte le raccolte nello stesso tubo.
Durante la raccolta finale, potrebbe essere più facile prelevare il liquido di lavaggio dal lato opposto del topo. Quindi, centrifugare le celle e risospenderle in 500 microlitri di terreno di placcatura. Quindi, contare i macrofagi vitali e risospenderli a 1 milione per millilitro. Ora, piastrellate 100 microlitri di sospensione nei pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Quindi, incubare le cellule per un'ora.
I macrofagi peritoneali aderiranno alla placca. Quindi, rimuovere le cellule non aderenti e sciacquare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di IMDM caldo. Dopo ogni lavaggio, attendere 10 secondi e inclinare lentamente la piastra per raccogliere la soluzione di risciacquo. Dopo i lavaggi, aggiungere nuovamente 100 microlitri di terreno di placcatura e posizionare la piastra nell'incubatrice.
Per l'ELISA, continuare a incubare le cellule senza stimolazione per 24 ore. Quindi, raccogliere e chiarire il terreno condizionato per l'analisi delle citochine.