Una tecnica ex vivo per indurre la morte neuronale tramite cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti

Gli oligodendrociti, che sono cellule specializzate del sistema nervoso centrale, formano guaine mieliniche attorno ai neuroni. La mielina isola l'assone e facilita la rapida conduzione degli impulsi elettrici. La demielinizzazione – la distruzione della mielina – porta alla morte neuronale.

Per studiare la morte neuronale, prendiamo un cervello di topo transgenico fissato su una piastra vibratomica. Immergere il cervello in un tampone ghiacciato, preservando l'integrità strutturale durante il sezionamento.

Utilizzando un vibratomo, ottenere sezioni coronali sottili. Trasferire le sezioni in un pozzetto di coltura contenente un mezzo appropriato.

Gli oligodendrociti nel cervello del topo transgenico esprimono un antigene estraneo, che viene visualizzato sulla superficie cellulare attraverso il complesso maggiore di istocompatibilità.

Aggiungere una soluzione di cellule T CD8+ attivate, specifiche per l'antigene estraneo, sulle sezioni e incubare.

Il recettore delle cellule T si lega al suo antigene visualizzato sull'oligodendrocita. La molecola co-stimolatrice si lega al suo ligando. Il legame avvia una cascata di segnalazione all'interno della cellula T, causando il rilascio di perforina e granzimi, mediatori citotossici.

La perforina crea pori nella membrana degli oligodendrociti, attraverso i quali i granzimi entrano nel citoplasma. Inoltre, i ligandi Fas sulle cellule T si legano ai loro recettori sulla superficie degli oligodendrociti. I granzimi, insieme al legame con il ligando Fas, inducono la via apoptotica negli oligodendrociti, portando alla demielinizzazione e alla morte neuronale.

Dopo l'incubazione, le sezioni cerebrali trattate sono pronte per la valutazione della morte cellulare.

Per questo esperimento, avere topi ODC-OVA transgenici di 8-10 settimane e controlli C57Bl/6 di pari età e sesso. Come al solito, ospita i topi in un ambiente privo di agenti patogeni con libero accesso a cibo e acqua. Dopo aver anestetizzato un topo, usa un pizzico con la zampa posteriore per valutare il livello di anestesia, quindi esegui immediatamente l'eutanasia.

Ora posiziona un topo ventralmente, disinfetta il cuoio capelluto e decapitalo. Quindi, rapidamente, taglia il cuoio capelluto, apri il cranio e scava il cervello. Fissare il cervello in posizione usando la colla e trasferirlo su una piastra di vibratomo, quindi riempire la piastra con soluzione fisiologica ghiacciata. Una volta preparate, tagliate delle fette da 300 micron. Trasferire le fette in pozzetti individuali di una piastra a 12 o 24 pozzetti riempita con aCSF. Quindi aggiungere con cura 1/2 milione di cellule T OT-I a ciascuna fetta.

Mezzo milione di cellule attivate per fetta fornisce una buona interazione cellula-cellula. Una volta che le cellule iniziano a migrare nella fetta, allo stesso tempo, la quantità di cellule non è troppo alta per indurre una reazione eccessiva. Quindi il conteggio di una singola cellula è fattibile.

Dopo aver caricato tutti i pozzetti, incubare la co-coltura per un massimo di otto ore. Dopo l'incubazione, raccogliere le fette e incorporarle nel composto OCT, quindi congelare le fette incorporate in azoto liquido e conservarle a 20 gradi Celsius negativi per ulteriori studi istologici.