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Immunologia
0 visualizzazioni • 8:18 min • July 8th, 2025
Per studiare l'immunità indotta dal vaccino, fare un'iniezione riempita con un vaccino acellulare contro la pertosse. Il vaccino contiene proteine antigeniche di un batterio che causa malattie respiratorie – Bordetella pertussis, e adiuvanti che estendono l'esposizione all'antigene per una risposta immunitaria sostenuta.
Iniettare il vaccino per via intramuscolare in un topo anestetizzato.
Dopo l'iniezione, le cellule presentanti l'antigene residente, le APC, catturano e trasformano le proteine antigeniche in peptidi, presentandole sulla loro superficie. Queste APC migrano quindi verso i linfonodi vicini e interagiscono con le cellule T, avviando la loro attivazione e differenziazione in cellule T effettrici.
Queste cellule T effettrici circolano e migrano in vari organi, compresi i polmoni, dove risiedono come cellule T di memoria residenti o celluleT RM, portando all'immunizzazione.
Dopo l'immunizzazione, somministrare per via intranasale un ceppo di Bordetella pertussis vivo resistente agli antibiotici. Questi batteri entrano nel tessuto polmonare e attivano le cellule TRM. Le cellule TRM attivate secernono citochine infiammatorie che reclutano le cellule immunitarie per causare l'eliminazione batterica.
Raccogliere il tessuto polmonare del topo e omogeneizzarlo per ottenere una sospensione unicellulare. Stendere la sospensione cellulare diluita su una piastra di agar contenente antibiotici e incubarla per consentire la formazione di colonie batteriche.
L'estratto di tessuto di un topo immunizzato mostra meno colonie rispetto a quello di un topo non immunizzato, confermando l'immunità indotta dal vaccino contro la Bordetella pertussis.
Per l'immunizzazione, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi in un topo anestetizzato di età compresa tra 6 e 12 settimane e caricare una siringa da insulina da 1 millilitro dotata di un ago calibro 28,5 con 0,1 millilitri del vaccino di interesse. Tenendo la siringa a un angolo di 45 gradi con lo smusso rivolto verso l'alto, inserire l'ago di circa 5 millimetri nel deltoide del topo e iniettare il vaccino.
Tenere l'ago inserito nel muscolo per 5-10 secondi. Quindi, ruotare la siringa di 180 gradi in modo che lo smusso sia rivolto verso il basso per creare un sigillo e per evitare perdite di vaccino prima di ritrarre lentamente l'ago dal sito di iniezione. Quindi, rimetti il topo nella sua gabbia con monitoraggio fino al completo recupero.
Circa due settimane dopo il richiamo, infettare i topi immunizzati. Afferrare un topo anestetizzato per la collottola del torace dorsale dietro le scapole e il collo e posizionare il topo in posizione verticale per accedere al naso. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, applicare lentamente da 20 a 25 microlitri dell'inoculo batterico di interesse su ogni strato dell'animale, tenendo il topo fino a quando l'intero inoculo non è stato inalato. Quindi, somministrare un volume uguale di PBS sterile a un gruppo di topi come controllo negativo.
Al punto finale sperimentale appropriato, posizionare un topo infetto con il lato ventrale rivolto verso l'alto su una tavola di dissezione e fissare gli arti. Inumidisci il corpo con etanolo al 70% e usa una pinza per stringere la pelle sotto l'addome al centro del bacino. Usando le forbici affilate, fai un taglio verticale fino alla mandibola e seziona la pelle dalla parete peritoneale. Sposta la pelle ai lati della carcassa per creare un campo libero per il prelievo sterile di organi e afferra il peritoneo intatto sotto la gabbia toracica in corrispondenza o vicino al fegato. Taglia il peritoneo verso la gabbia toracica per esporre il tratto digestivo inferiore e sposta il colon a sinistra per rivelare la milza.
Usando una pinza curva, afferra la milza e seziona il tessuto connettivo con le forbici. Quindi, metti la milza in un tubo conico da 15 millilitri contenente 3 millilitri di RPMI e il 5% di siero fetale bovino su ghiaccio. Usa una pinza per stabilizzare la gabbia toracica durante il processo xifoideo e taglia il diaframma. I polmoni dovrebbero sgonfiarsi e cadere verso la colonna vertebrale.
Tagliare la gabbia toracica ai lati per rimuovere la corazza e tagliare le arterie polmonari e le vene per isolare e rimuovere il lobo superiore del polmone destro. Fissare il lobo in una provetta conica da 15 millilitri di formalina tamponata neutra al 10% a temperatura ambiente per almeno 24 ore e isolare i lobi rimanenti dei polmoni destro e sinistro. Quindi, posizionare i lobi in un tubo conico da 15 millilitri contenente 2 millilitri di caseina all'1% in PBS su ghiaccio.
Utilizzare un PIPETMAN da 1 millilitro con punta per raccogliere il sangue che riempie la cavità toracica e trasferire il sangue in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-etichettata su ghiaccio. Rimuovere le ghiandole parotide, sublinguali e sottomascellari e i linfonodi che coprono la trachea e aprire e rimuovere le membrane protettive che circondano la trachea. Usando pinze sottili e forbici, separa accuratamente la trachea dall'esofago e qualsiasi altro tessuto connettivo dalla parte superiore delle clavicole alla parte inferiore della mandibola.
Usa una pinza per tenere la trachea e taglia la trachea nella parte superiore della clavicola. Tirare verso il basso la trachea per massimizzare l'elasticità e tagliare la trachea nella parte inferiore della mandibola proprio sopra la laringe, isolando circa 1 centimetro di tessuto. Quindi, posizionare l'organo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-marcata contenente 0,3 millilitri di caseina all'1% in PBS su ghiaccio.
Ora, gira il mouse per un chiaro accesso al naso e spruzza la testa con il 70% di etanolo. Manualmente, afferra l'animale direttamente dietro il cranio e usa le forbici per tagliare via la carne morbida del muso, partendo dalla parte inferiore del naso e salendo verso l'alto. Rimuovi il pelo, la pelle e i baffi intorno al naso e inserisci le punte di un paio di forbici curve nelle narici con le curve rivolte verso il basso.
Taglia il passaggio nasale verso gli occhi, creando una formazione a V. Quindi, utilizzare una pinza fine per raccogliere il setto nasale e i tessuti molli all'interno della formazione e posizionare il tessuto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-marcata contenente 0,3 millilitri di caseina all'1% in PBS su ghiaccio.
Per elaborare il tessuto polmonare, trasferire l'intero contenuto della provetta del campione polmonare in un omogeneizzatore sterile da 15 millilitri e utilizzare un pestello per omogeneizzare il tessuto. Dissociare il campione fino a quando non rimangono particelle di tessuto di grandi dimensioni e riportare la sospensione omogeneizzata nella provetta originale da 15 millilitri. Rimuovere un'aliquota da 0,3 millilitri per la placcatura delle unità formanti colonie e raccogliere il resto dell'omogeneizzato mediante centrifugazione.
Aliquotare 0,5 millilitri di surnatante in provette da microcentrifuga pre-marcate per la conservazione a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi dell'espressione delle citochine mediante ELISA. Quindi, diluire in serie 0,1 millilitri di aliquote della sospensione polmonare omogeneizzata messa da parte in 0,9 millilitri di PBS sterile per diluizione e utilizzare uno spandiconcime triangolare sterile per placcare 0,1 millilitri di ciascuna diluizione scelta empiricamente su piastre Bordet-Gengou al 10% pre-marcate più streptomicina.