Dinamica degli organelli nei linfociti B dopo l'attivazione con perle rivestite di antigene

I recettori delle cellule B, BCR, sui linfociti B, legano gli antigeni, provocando l'attivazione cellulare. Ciò porta all'internalizzazione dell'antigene per la trasformazione in frammenti peptidici, che vengono caricati su molecole MHC di classe II per la presentazione ai linfociti T helper per generare una risposta immunitaria efficace.

Per studiare l'attivazione dei linfociti B in vitro utilizzando perle rivestite di antigene, in primo luogo, ottenere perle rivestite di antigene. Queste perle sono rivestite covalentemente con antigeni, ligandi specifici per BCR; una proteina non reattiva blocca i siti delle perle non legate, impedendo il legame non specifico dei linfociti B.

Aggiungere le perle alla sospensione dei linfociti B. Seminare la miscela su un vetrino coprioggetti rivestito di poli-L-lisina.

I linfociti B caricati negativamente si legano al vetrino coprioggetti caricato positivamente, immobilizzando le cellule. Inoltre, gli antigeni delle perle si legano specificamente ai BCR. L'interazione del BCR con l'antigene attiva i linfociti B, formando una giunzione stretta, una sinapsi immunitaria.

L'interazione avvia le vie di segnalazione intracellulare, con conseguente riorganizzazione del citoscheletro di actina. Ciò provoca la diffusione della membrana cellulare seguita da una contrazione, durante la quale il microcluster BCR-antigene si concentra al centro della sinapsi immunitaria.

Con il rimodellamento dell'actina, il centrosoma – un centro organizzativo dei microtubuli – si riposiziona vicino alla sinapsi. Il riposizionamento recluta organelli come i lisosomi e l'apparato di Golgi vicino alla sinapsi immunitaria per estrarre e presentare gli antigeni.

Le perle rivestite di antigene vengono preparate incubando ligandi specifici con perle di amminico precedentemente trattate con glutaraldeide per attivare i gruppi amminici. Risospendere le perle attivate in 100 microlitri di PBS e vortex. Nel frattempo, preparare la soluzione antigenica aggiungendo 100 microgrammi per ml di ligando BCR in 150 microlitri di PBS.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di perle attivate alla soluzione dell'antigene e incubare per una notte a 4 gradi Celsius. Ricorda, usa anche un ligando non correlato come controllo negativo. Dopo l'incubazione, lavare la perlina con PBS, aspirare il surnatante e sostituirlo con PBS. Ripeti tre volte. Successivamente, bloccare i gruppi amminici liberi risospendendo le perle in 500 microlitri di una soluzione di BSA. Infine, risospendere le perle in 70 microlitri di PBS.

Per calcolare la concentrazione finale, è possibile utilizzare un emocitometro per contare le perle. Per l'attivazione delle cellule B, utilizzare una provetta da 50 ml e risospendere le cellule a una concentrazione di 1,5 milioni per ml in CLICK integrato con il 5% di siero fetale bovino. Quindi, aggiungere 150.000 cellule B corrispondenti a 100 microlitri della miscela di perle cellulari a un vetrino coprioggetti rivestito di poli-L-lisina e incubare a 37 gradi per i diversi punti temporali.