Effetto dell'anticorpo anti C-fms sull'osteoclastogenesi nelle cellule del midollo osseo di topo in vitro

L'osteoclastogenesi è il processo mediante il quale i precursori degli osteoclasti si differenziano e si fondono per formare osteoclasti multinucleati.

Per studiare l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sull'osteoclastogenesi in vitro, prelevare una piastra di coltura contenente una sospensione di cellule di midollo osseo di topo. Aggiungere il fattore stimolante le colonie di macrofagi, M-CSF.

In coltura, M-CSF si lega al suo recettore specifico, c-fms, sulle cellule precursori mieloidi, attivando le vie di segnalazione e causando il differenziamento in macrofagi del midollo osseo, i BMM, che rappresentano i precursori degli osteoclasti e aderiscono alla piastra.

Rimuovere le celle non aderenti. Raccogli i BMM e seminali su pozzetti a piastre multipozzetto. Integrare con M-CSF e attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare kappa-Β, RANKL.

Aggiungere concentrazioni crescenti di anticorpi anti-c-fms ai pozzetti.

Nel pozzetto di controllo, M-CSF si lega ai recettori c-fms e attiva le vie di segnalazione, stimolando l'espressione del recettore RANK e promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione del BMM. RANKL si lega ai recettori RANK, innescando una cascata di segnalazione e causando la differenziazione e la fusione di BMM negli osteoclasti.

Nei pozzetti con concentrazioni di anticorpi più elevate, gli anticorpi si legano e bloccano efficacemente i recettori c-fms e interrompono la segnalazione necessaria per la differenziazione degli osteoclasti, inibendo così la formazione di osteoclasti.

Eseguire la colorazione per identificare e quantificare le popolazioni di osteoclasti e determinare l'efficace concentrazione di anticorpi per inibire l'osteoclastogenesi nella formazione di osteoclasti indotta da RANKL.

Semina 10 milioni di cellule per 10 millilitri in una piastra di coltura di 10 centimetri e aggiungi M-CSF alle cellule. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 3 giorni. Rimuovere il terreno dopo tre giorni e lavare le cellule due volte, energicamente, con 10 millilitri di PBS per rimuovere le cellule non aderenti.

Aggiungere 5 millilitri di tripsina-EDTA a temperatura ambiente allo 0,02% in PBS e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 5 minuti. Pipettare accuratamente le cellule per staccarle. Osservare la coltura al microscopio per assicurarsi che le cellule siano state staccate e appaiano arrotondate e fluttuanti nei terreni.

Quando le cellule sono state staccate, inattivare la reazione aggiungendo 5 millilitri di alfa-MEM. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, lavare con 5 millilitri di alfa-MEM e centrifugare nuovamente a 300 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet in 10 millilitri di alfa-MEM.

Semina 1 milione di cellule per 10 millilitri in una piastra di coltura di 10 centimetri e aggiungi M-CSF. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 3 giorni. Raccogliere le cellule attaccate, che rappresentano i BMM come precursori degli osteoclasti dopo 3 giorni. Seminare BMM a 50.000 cellule per 200 microlitri di alfa-MEM in una piastra a 96 pozzetti, per pozzetto.

A ciascun pozzetto, aggiungere gli stimoli desiderati, quindi aggiungere M-CSF per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro. Aggiungere l'anticorpo anti-c-fms a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 4 giorni, cambiando il terreno a giorni alterni per 4 giorni, quindi procedere con la colorazione e i saggi come descritto nel manoscritto.