JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:50 min • July 8th, 2025
Il destrano solfato di sodio, o DSS, induce la colite, una malattia infiammatoria intestinale, in cui la rottura della barriera epiteliale intestinale porta all'infiammazione.
Per valutare il danno tissutale, prelevare il tessuto del colon fisso isolato da un modello murino di colite indotta da DSS. Immergere il tessuto in un mezzo di inclusione per facilitare il sezionamento e congelare rapidamente.
Utilizzando un crio-microtomo, ottenere una sottile sezione di tessuto e raccoglierla su un vetrino.
Immergere il vetrino in una soluzione contenente colorante ematossilina ossidato legato al mordente - un catione metallico - che conferisce una carica positiva al colorante. Il complesso colorante-mordente si lega al DNA caricato negativamente, colorando il nucleo di colore rossastro-violaceo.
Immergere il tessuto in una soluzione acido-alcolica differenziante, rimuovendo il colorante non specificamente legato dal citoplasma e dalla matrice extracellulare. Sciacquare il fazzoletto con un agente azzurrante, un mezzo alcalino, che conferisce un colore blu ai nuclei, migliorando il contrasto.
Immergere il vetrino in concentrazioni crescenti di alcol per disidratare il tessuto migliorando la penetrazione del controcolorante.
Immergere il tessuto nel colorante di contrasto - soluzione di eosina acida - conferendo colore rosa alle proteine citoplasmatiche di base e alla matrice extracellulare. Lavare il vetrino con alcool per rimuovere l'eosina in eccesso. Immergi il tessuto nello xilene per renderlo trasparente, per un migliore esame microscopico.
Al microscopio, la sezione del colon mostra un danno tissutale aggravato, indicando una colite indotta da DSS.
Per la colorazione con ematossilina ed eosina del tessuto del colon isolato, la mattina successiva, immergere i pezzi di tessuto in saccarosio al 30% in PBS per una notte in singole provette da 15 millilitri per la crioprotezione dei campioni. Il giorno successivo, incorporare i tessuti nella temperatura di taglio ottimale o nel composto OCT e raffreddare i tessuti a meno 20 gradi Celsius fino a quando l'OCT non si indurisce.
Posizionare i blocchi OCT in un criostato e impostare il quadrante dello spessore a 12 micrometri, quindi affettare e raccogliere sezioni congelate spesse 12 micrometri su vetrini da microscopio. Quando tutti i tessuti sono stati sezionati, riscaldare i vetrini a 65 gradi Celsius su una piastra calda per 20 minuti e lavare brevemente le sezioni riscaldate in acqua distillata prima di colorare con soluzione colorante di ematossilina per 5 minuti.
Rimuovere la soluzione di ematossilina in eccesso nell'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti e differenziare le sezioni con acido cloridrico allo 0,5% in etanolo per 30 secondi, seguito da un risciacquo di 1 minuto sotto l'acqua corrente del rubinetto. Quindi, lavare i campioni per 1 minuto in PBS, seguito da un altro lavaggio di 5 minuti sotto l'acqua corrente del rubinetto.
Al termine del lavaggio, immergere i fazzoletti in una serie ascendente di etanolo per 10 secondi per immersione, seguita da una controcolorazione in eosina per 2 minuti. Per la disidratazione dei campioni, immergere i vetrini in etanolo al 95% e 2 cambi di etanolo al 100% per 5 minuti per immersione, seguiti da una pulizia con due cambi di xilene della durata di 5 minuti. Quindi, segnare il danno tissutale al colon prossimale, medio e distale di ciascun gruppo sperimentale.