Analisi dell'effetto dei preparati a base di prodotti del tabacco sulla produzione di citochine tramite colorazione intracellulare e citometria a flusso

Dopo l'interazione con stimolanti infiammatori, le cellule immunitarie rilasciano molecole di segnalazione infiammatoria - citochine - per produrre una risposta immunitaria.

Per analizzare l'effetto dei preparati a base di prodotti del tabacco, TPP, prelevare una piastra a più pozzetti con concentrazioni crescenti di TPP. Seminare la piastra con cellule mononucleate del sangue periferico umano, PBMC contenenti cellule immunitarie.

La nicotina, un agente immunosoppressore nei TPP, si lega ai recettori nicotinici dell'acetilcolina, riducendo la produzione di citochine pro-infiammatorie. Questa sottoregolazione è dose-dipendente, con concentrazioni più elevate che hanno un effetto più significativo.

Centrifugare per pellettare le celle ed eliminare il surnatante contenente residui di TPP.

Risospendere le cellule in un mezzo completo e aggiungere una miscela contenente lipopolisaccaride, uno stimolatore immunitario, e GolgiPlug, un inibitore del trasporto proteico.

Le molecole di lipopolisaccaridi interagiscono con le cellule immunitarie contenenti il recettore toll-like-4, innescando vie di segnalazione intracellulari e la produzione di citochine pro-infiammatorie. Nel frattempo, le molecole di GolgiPlug bloccano la secrezione di citochine dall'apparato di Golgi, consentendone l'accumulo.

Fissare le cellule con una soluzione fissativa e permeabilizzarle con un agente che forma i pori. Sovrapporre le cellule con un cocktail di anticorpi anti-citochine marcati con fluorofori, che entrano attraverso i pori e si legano alle rispettive citochine intracellulari.

Analizza le cellule colorate mediante citometria a flusso, che misura i segnali di fluorescenza.

Determinare il livello di produzione di citochine; una riduzione dose-dipendente indica l'effetto immunosoppressivo dei TPP.

Prima di iniziare la procedura di colorazione, diluire il terreno intero condizionato con fumo e la nicotina alle concentrazioni indicate nel terreno completo RPMI fino a un volume totale di 100 microlitri per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di PBMC sospesi in terreno completo a una concentrazione di 1 volte 10 alla sesta cellula per pozzetto, per un volume totale di 200 microlitri per pozzetto. Quindi, copri la piastra e incubala a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂.

Dopo tre ore, lavare le cellule e aspirare il surnatante. Quindi, coprire nuovamente la piastra e agitarla per dissociare i pellet. Lavare le celle altre due volte, una volta in tampone di corsa ghiacciato e una volta in mezzo completo.

Dopo il secondo lavaggio, trattarli con 200 microlitri per pozzetto di terreno completo, integrati con GolgiPlug e LPS per 6 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂. Quindi, lavare le cellule con un tampone di corsa ghiacciato e trattarle con 100 microlitri di Cytofix per pozzetto a 4 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, lavare le celle tre volte con permwash ghiacciato.

Quindi, aggiungere 45 microlitri di Cytoperm a ciascun pozzetto, seguiti da 5 microlitri di ciascuno degli anticorpi elencati. Dopo 30 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule tre volte e fissarle in 200 microlitri di paraformaldeide ghiacciata al 2%. Quindi, trasferire le cellule in provette da 12 x 75 millimetri e analizzare i campioni su un citometro a flusso.