Sintesi di biofilm in vitro da parte di Staphylococcus aureus

I biofilm batterici sono strutture tridimensionali costituite da comunità batteriche incorporate in una matrice extracellulare autogenerata, che eludono la risposta immunitaria dell'ospite.

Per la preparazione in vitro del biofilm di Staphylococcus aureus, trasferire una sospensione di Staphylococcus aureus in crescita attiva della densità cellulare desiderata nei pozzetti rivestiti di poli-L-lisina di una piastra a più pozzetti.

Durante l'incubazione in condizioni statiche, il rivestimento in poli-L-lisina caricata positivamente facilita le interazioni elettrostatiche con i glicopolimeri caricati negativamente, come gli acidi teicoici, sulla superficie batterica, favorendo l'adesione batterica.

Con le fonti di nutrienti disponibili, lo Staphylococcus aureus si divide e si accumula, formando microcolonie. Inoltre, i batteri secernono una matrice extracellulare che comprende polisaccaridi, proteine e DNA extracellulare, che racchiude le cellule e promuove la coesione batterica e l'adesione superficiale.

Con la continua divisione cellulare e la secrezione di matrice, il biofilm matura in una struttura tridimensionale con un'efficiente distribuzione delle molecole di segnalazione per la comunicazione da cellula a cellula.

Al raggiungimento di una soglia di densità batterica, lo Staphylococcus aureus secerne proteasi e nucleasi, degradando la matrice del biofilm e rilasciando alcuni Staphylococcus aureus nel terreno. Rimuovere il terreno contenente batteri planctonici che galleggiano liberamente.

Aggiungere delicatamente un tampone per prevenire la rottura del biofilm. Rimuovere il tampone contenente eventuali batteri non attaccati rimanenti.

Il biofilm generato è pronto per gli esperimenti a valle.

Inizia ottenendo colonie isolate di Staphylococcus aureus da un ceppo crioconservato utilizzando una tecnica di piastra a strisce su una piastra di agar ricca di sostanze nutritive come l'agar di soia triptico. Rivestire i singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di PLL diluiti in acqua sterile e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aspirare la soluzione PLL in modo asettico, utilizzando una trappola di aspirazione assistita dal vuoto. Lasciare asciugare i pozzetti per una notte a temperatura ambiente.

Preparare una coltura notturna inoculando una colonia di S. aureus in MEM-alfa integrata con glucosio al 2% e incubarla a 37 gradi Celsius per 16-18 ore a 200 rotazioni al minuto. Diluire la coltura notturna trasferendo da 50 microlitri a 5 millilitri di MEM-alfa fresco integrato con glucosio al 2%. Quindi, incubarlo a 37 gradi Celsius a 200 rotazioni al minuto fino a raggiungere la fase medio-logaritmica. Utilizzare MEM-alfa per normalizzare la coltura medio-logaritmica a un OD di 0,1.

Trasferire 150 microlitri di coltura normalizzata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti trattata con PLL. Incubare la piastra in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 18-20 ore. Aspirare il surnatante per rimuovere le cellule planctoniche. Lavare delicatamente, la biomassa rimanente con 150 microlitri di HBSS per rimuovere le cellule non attaccate. Ripetere almeno due volte per rimuovere tutte le cellule planctoniche.