Una tecnica in vitro per stimolare i linfociti attraverso batteri patogeni

Per stimolare i linfociti tramite Haemophilus influenzae, un batterio patogeno, assumere una sospensione di cellule mononucleate isolate del sangue periferico, o PBMC, inclusi i linfociti e le cellule presentanti l'antigene o APC.

Aggiungere una sospensione batterica e incubare a temperatura fisiologica.

I recettori di riconoscimento dei pattern sulle APC si legano a componenti specifici delle cellule batteriche, innescando la fagocitosi. Il fagosoma, contenente batteri internalizzati, si fonde con il lisosoma, causando la degradazione batterica e la trasformazione in frammenti peptidici.

Il complesso maggiore di istocompatibilità o molecole MHC si legano ai frammenti peptidici e li presentano sulla superficie cellulare come antigeni. I linfociti T si legano all'antigene presentato attraverso il recettore delle cellule T.

Aggiungere anticorpi co-stimolatori che si legano a specifici recettori di superficie sui linfociti T. Il legame sinergico induce la segnalazione a valle, attivando la produzione di citochine dei linfociti T.

Aggiungere un composto bloccante del Golgi – che blocca il trasporto delle proteine vescicolari dal reticolo endoplasmatico al Golgi – per inibire la secrezione di citochine dai linfociti T, facilitando l'accumulo intracellulare di citochine.

Aggiungere un fissativo per preservare la morfologia cellulare e un detergente per permeabilizzare la membrana cellulare. Aggiungere un cocktail di anticorpi marcati in fluorescenza, inclusi gli anticorpi che si legano ai marcatori di superficie specifici dei linfociti T – che marcano la superficie cellulare – e gli anticorpi specifici per le citochine che penetrano all'interno della cellula per legare le citochine intracellulari.

Eseguire la citometria a flusso per rilevare le cellule con doppia fluorescenza, che indica la produzione di citochine da parte dei linfociti T stimolati.

Dividere il campione di sangue periferico in aliquote per il controllo e la stimolazione dell'antigene. Aggiungere anticorpi co-stimolatori a entrambi i campioni, quindi aggiungere l'H. influenzae non tipizzabile al campione di antigene e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 1 ora.

Successivamente, aggiungere l'agente bloccante del Golgi Brefeldin A ai campioni e incubarli per altre cinque ore. Dopo aver lisinato gli eritrociti come dimostrato in precedenza, fissare i leucociti utilizzando 500 microlitri di paraformaldeide dall'1% al 2% per 1 ora. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, quindi permeabilizzare 1 milione di cellule con 100 microlitri di saponina allo 0,1% per 15 minuti.

Successivamente, incubare le cellule con anticorpi marcati con fluorescenza appropriati. Lavare le cellule, quindi analizzarle utilizzando un citometro a flusso. Determinare la proporzione di cellule che rispondono all'antigene controllando le popolazioni di linfociti pertinenti. Eseguire la colorazione di fondo su cellule non stimolate per tutte le citochine da analizzare.