Uccisione delle cellule K562 da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico esposte a preparazioni di prodotti del tabacco

Le cellule tumorali attivano le cellule immunitarie effettrici per rilasciare citochine e granuli citolitici contenenti perforina e granzimi. La perforina forma pori nella membrana cellulare tumorale, facilitando l'ingresso del granzima nella cellula e avviando l'apoptosi, causando la morte cellulare.

Per analizzare la funzione citolitica delle cellule mononucleate del sangue periferico umano, le PBMC, dopo la preparazione del prodotto del tabacco, TPP, esposizione, prelevare una piastra multipozzetto con concentrazioni crescenti di TPP. Un pozzetto contenente il fluido funge da controllo.

Aggiungere la sospensione PBMC. L'agente immunosoppressore primario dei TPP, la nicotina, si lega ai recettori nicotinici dell'acetilcolina delle PBMC, sottoregolando la produzione di citochine pro-infiammatorie.

centrifuga. Rimuovere il surnatante contenente TPP. Risospendere le PBMC nel supporto. Aggiungere ai pozzetti cellule K562 marcate in fluorescenza, cellule leucemiche umane che hanno una maggiore suscettibilità alla citotossicità delle cellule effettrici PBMC.

Le

cellule effettrici trattate con TPP con risposte immunitarie soppresse mostrano una ridotta espressione di perforina e rilascio di citochine, diminuendo la capacità citolitica della PBMC.

centrifuga. Risospendere le cellule in un tampone seguito da un colorante fluorescente impermeabile alle cellule. Il colorante entra nelle cellule con membrane compromesse e colora il DNA.

Utilizzando un citometro a flusso, determinare la proporzione di cellule K562 morte e vive nei pozzetti. Una percentuale inferiore di cellule K562 morte in pozzetti con concentrazioni di TPP più elevate rispetto al controllo indica la soppressione dell'uccisione delle cellule K562 da parte di PBMC trattate con TPP.

Dopo aver preparato una piastra di PBMC trattate con prodotti del tabacco, come appena dimostrato, lavare una coltura di cellule K562 raccolte all'80% in 10 millilitri di DPBS. Risospendere il pellet in 5 millilitri di DPBS e contare le cellule. Quindi, aggiungere 1 millilitro di soluzione di lavoro CFSE appena preparata a 1 o 2 volte 10 alla settima cellula K562 in 1 millilitro di terreno completo e disperdere la macchia cellulare mediante vortex.

Incubare le cellule a temperatura ambiente. Dopo esattamente 2 minuti, aggiungere 200 microlitri di FBS e agitare nuovamente le cellule, incubandole per altri due minuti.

Dopo la seconda incubazione, lavare le cellule in 10 millilitri di terreno completo. Quindi, risospendere il pellet in altri 10 millilitri di terreno completo e contare le celle. Ora, centrifugare i PBMC trattati con tabacco e decantare il surnatante. Quindi, riposizionare il coperchio, risospendere le cellule mediante vortice e lavarle in 200 microlitri di terreno completo per pozzetto.

Per avviare il test di uccisione, aggiungere le cellule K562 marcate con CFSE alle PBMC con un rapporto di 1 a 15 e incubare la co-coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Dopo cinque ore, centrifugare le cellule e scartare il surnatante. Risospendere i pellet mediante vortex, quindi lavare le celle con 200 microlitri di tampone di corsa per pozzetto. Quindi, aggiungere 95 microlitri di tampone di corsa seguiti da 5 microlitri di 7-AAD, per un volume totale di 100 microlitri per pozzetto.

Infine, incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di corsa a ciascun pozzetto e trasferire l'intero volume nelle provette FACS corrispondenti appropriate per determinare la percentuale di cellule 7-AAD e CFSE-positive mediante analisi citofluorimetrica.