JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:12 min • July 8th, 2025
Per studiare l'impatto degli antimicrobici sugli aggregati batterici, prendere la coltura di Pseudomonas aeruginosa in un terreno di coltura che promuove la formazione di aggregati, simulando la crescita durante l'infezione.
I batteri ingegnerizzati esprimono una proteina fluorescente per la rilevazione degli aggregati al microscopio a fluorescenza. Immagine in tre dimensioni per calcolare il volume degli aggregati, o la biomassa batterica, e visualizzare l'aumento della biomassa nel tempo, indicando la crescita batterica.
Aggiungi la colistina, un peptide antimicrobico cationico, a una concentrazione subletale che uccide i batteri sensibili selezionando quelli tolleranti agli antibiotici.
La colistina si lega ai lipopolisaccaridi caricati negativamente, o LPS, sulla membrana esterna batterica, spostando i ponti cationici che stabilizzano il monostrato LPS, danneggiando l'integrità della membrana.
La colistina entra nel periplasma e si lega all'LPS sulla membrana cellulare, interrompendo la membrana e provocando la lisi cellulare. Come contromeccanismo, specifiche mutazioni genetiche in un sottogruppo di batteri neutralizzano la carica negativa di LPS. Questa modifica inibisce l'interazione elettrostatica della colistina cationica con LPS meno anionico, prevenendo la morte cellulare.
Immagine per visualizzare la diminuzione della biomassa con il tempo, indicando l'impatto dell'antimicrobico. Aggiungi ioduro di propidio o PI – un colorante fluorescente – che entra attraverso la membrana danneggiata per legare il DNA, etichettando solo le cellule morte.
Eseguire la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, o FACS, separando le cellule sensibili marcate con PI e le cellule tolleranti agli antibiotici marcate con fluorescenza. Le cellule sono pronte per i saggi a valle.
Per visualizzare gli aggregati di Pseudomonas aeruginosa al microscopio confocale a scansione laser, al termine dell'incubazione, designare tre pozzetti della piastra di coltura come repliche del trattamento antibiotico in un pozzetto e posizionare il "controllo senza trattamento" e posizionare la piastra sul tavolino riscaldato del microscopio.
Selezionare un obiettivo a immersione in olio 63 volte e aprire la scheda Localizza per identificare gli aggregati batterici nel campo chiaro. Definire un'area per l'imaging all'interno di ciascun pozzetto e utilizzare il modulo Posizioni per memorizzare la posizione dell'area. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 509 nanometri.
Nel modulo Acquisizione, selezionare l'opzione Z-Stack per acquisire le immagini e utilizzare il modulo Line Averaging per ridurre la fluorescenza di fondo nel canale GFP all'interno del volume totale delle immagini Z-stack. Impostare l'opzione Serie temporale per acquisire 60 sezioni in ciascun pozzetto a intervalli di 15 minuti per 18 ore e utilizzare la strategia di messa a fuoco definita per memorizzare un piano focale per ogni posizione che verrà ri-immagine in ogni punto temporale durante l'esperimento.
4,5 ore dopo l'impostazione dell'esperimento di imaging, visualizzare ogni posizione per determinare la biomassa aggregata all'interno di ciascuno dei quattro pozzetti prima dell'aggiunta dell'antibiotico. Dopo sei ore, aggiungere delicatamente l'antibiotico a due volte al di sotto della concentrazione inibitoria minima al centro di ciascun pozzetto, appena sotto l'interfaccia aria-liquido, e fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'imaging del trattamento post-antibiotico.
Per isolare le cellule vive, al termine del periodo di imaging di 18 ore, etichettare i batteri in ciascun pozzetto con il volume appropriato di ioduro di propidio, secondo le raccomandazioni del produttore. Al termine dell'incubazione, utilizzare un contenitore isolato per trasferire la piastra al citometro a flusso e impostare il citometro per rilevare GFP e ioduro di propidio utilizzando un ugello da 70 micron. Quindi, eseguire aliquote da 1 millilitro di ciascun surnatante di coltura alla velocità di flusso più bassa per selezionare gli aggregati vitali di Pseudomonas aeruginosa positivi allo ioduro di propidio e non vitali.