Quantificazione dell'infezione batterica nelle cellule ospiti mediante il saggio dell'unità formante colonia

Per iniziare il test dell'unità formante colonie, o CFU, per quantificare i batteri vitali, prelevare una piastra multipozzetto contenente macrofagi coltivati in terreni di crescita. Infettare i macrofagi con Listeria monocytogenes, un batterio patogeno in grado di crescere intracellulare.

Durante l'infezione, i macrofagi inghiottono i batteri, internalizzando i batteri all'interno di un compartimento legato alla membrana, un fagosoma.

I batteri secernono una tossina che forma i pori e interrompono la membrana fagosomiale. In questo modo, i batteri possono entrare nel citosol e replicarsi all'interno dei macrofagi.

Trattare brevemente i macrofagi infetti con gentamicina, un antibiotico che elimina selettivamente i batteri non internalizzati preservando i batteri intracellulari.

Aspirare il terreno sovrastante contenente antibiotici. Successivamente, aggiungi acqua distillata sterile sui macrofagi infetti, creando un ambiente ipotonico. Questo porta all'osmosi, in cui le molecole d'acqua entrano nelle cellule e causano la lisi dei macrofagi, rilasciando i componenti intracellulari, compresi i batteri.

Stendere il lisato cellulare contenente batteri intracellulari sulla piastra di agar lisogena, favorendo la separazione delle singole cellule batteriche e consentendone la crescita indipendente. Durante l'incubazione, i batteri vitali crescono sulla superficie dell'agar e formano colonie distinte.

Contare le colonie sulla piastra e ottenere le CFU, che rappresentano i batteri intracellulari che hanno eluso la risposta immunitaria dell'ospite e si sono replicati con successo all'interno dei macrofagi infetti.

Per raccogliere, inclinare leggermente il piatto e utilizzare con cautela una pipetta per rimuovere l'intero terreno dal pozzetto. Aggiungere 0,5 millilitri di acqua sterile distillata al pozzo. Dopo 30 secondi, trasferire il lisato d'acqua risultante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e agitare energicamente per 10 secondi.

Aggiungere 4,5 microlitri e 50 microlitri di lisato d'acqua a 450 microlitri di acqua sterile distillata per preparare le diluizioni 10 e 100 volte. In breve, vorticare per garantire una miscelazione accurata. Aggiungere 50 microlitri dei campioni originali diluiti 10 volte e diluiti 100 volte su piastre di agar per brodo di lisogenia e distribuire utilizzando uno spalmatore per piastre.

Per il test della Lm emergente, estrarre 10 microlitri del terreno di copertura dalla piastra e dividerlo in due aliquote da 5 microlitri in provette da microcentrifuga. Aggiungere 5 microlitri di DMEM/FCS a un'aliquota e aggiungere 5 microlitri di DMEM/FCS contenenti 5 microlitri per millilitro di gentamicina alla seconda aliquota come controllo.

Attendere 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 90 microlitri di acqua sterile distillata a ciascuna aliquota e agitare energicamente il tubo per 10 secondi. Quindi, aggiungere 50 microlitri di campione su piastre di agar LB e distribuire utilizzando uno spandiconcime. Conservare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per due giorni prima di enumerare le colonie di Lm.