JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:21 min • July 8th, 2025
Prendi una piastra a più pozzetti contenente una coltura di macrofagi. Infettare con Listeria monocytogenes che esprime proteine fluorescenti, Lm.
Le proteine su Lm si legano a specifici recettori macrofagici, internalizzando i batteri all'interno di un fagosoma. Inoltre, Lm secerne tossine che formano pori che distruggono la membrana del fagosoma, rilasciando batteri nel citosol, dove si replicano e vengono circondati da filamenti di actina ospite.
Le proteine ActA che inducono l'assemblaggio dell'actina su Lm inducono una polimerizzazione continua dell'actina nella parte posteriore del batterio. La coda della cometa di actina generata spinge Lm attraverso il citosol e penetra la membrana cellulare dei macrofagi, rilasciando Lm polimerizzato avvolto da actina nel mezzo.
Dopo l'incubazione, raccogliere e fissare i terreni extracellulari, legati all'actina, contenenti Lm da una serie di pozzetti. Fissare il Lm utilizzando la paraformaldeide. Aggiungere acqua distillata, rompendo i macrofagi e rilasciando la Lm intracellulare. Raccogliere la Lm intracellulare e fissare il campione utilizzando la paraformaldeide.
In altri pozzetti, sostituire i terreni con terreni contenenti gentamicina impermeabili alle cellule per eliminare la Lm extracellulare. Sostituire con terreno fresco e incubare per il periodo desiderato.
Dopo l'incubazione, raccogliere il terreno extracellulare contenente Lm e fissare il campione con paraformaldeide. Utilizzare acqua distillata per ottenere lisato contenente Lm intracellulare e fissare il campione con paraformaldeide. Aggiungere falloidina marcata in fluorescenza ai campioni, che si lega selettivamente all'actina polimerizzata.
Utilizzando un citometro a flusso, è possibile visualizzare i segnali fluorescenti provenienti da Lm e dalla falloidina legante l'actina nei campioni. Quantificare l'Lm extracellulare e intracellulare legato all'actina derivato dai macrofagi infetti.
Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, regolare le celle RAW 264.7 preparate alla concentrazione di 1 x 106 cellule per millilitro. Aggiungere 1 millilitro del campione ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Infettare le cellule con l'inoculo di Lm preparato corrispondente a una molteplicità di infezione di 50.
A 1,5 ore dall'infezione, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millimetri riempita con 500 microlitri di PFA al 4%, raccogliere il terreno dalla prima serie di pozzetti e posizionare la provetta sul ghiaccio. Per raccogliere la Lm intracellulare, aggiungere 1 millilitro di acqua sterile distillata a ciascun pozzetto. Dopo 60 secondi, trasferire il lisato d'acqua risultante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con 500 microlitri di PFA al 4%. Agitare energicamente il tubo per 10 secondi e posizionarlo sul ghiaccio.
Per i pozzetti rimanenti, rimuovere il terreno e sostituirlo con 1 millilitro di DMEM/FCS con 5 microgrammi per millilitro di gentamicina per uccidere la Lm extracellulare. Rimettere prontamente la capsula nell'incubatore.
Dopo 30 minuti, rimuovere il terreno e sostituirlo con DMEM/FCS senza gentamicina. Dopo altre due e quattro ore, raccogliere il terreno in lisati per la seconda e la terza volta nelle provette e posizionarle sul ghiaccio per raffreddarle. Centrifugare le provette a 10.000 volte g per 7 minuti.
Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il cocktail colorante contenente 50 microlitri di PFA al 4% e 15 microlitri di falloidina nel tubo e mescolare per risospendere ogni pellet. Incubare le provette al buio a 4 gradi Celsius per 20 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 1 millilitro di tampone FACS a ciascuna provetta e pipettare su e giù per miscelare. Centrifugare le provette nella centrifuga a 10.000 volte g per 7 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
Per un uso immediato, sospendere ogni pellet in 400 microlitri di tampone FACS. Se si conserva per un'analisi successiva, aggiungere 200 microlitri di tampone FACS e 200 microlitri di PFA al 4% nella provetta e mescolare per sospendere.