Name: Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min
Description: Impara le tecniche asettiche di piastratura per isolare, propagare e enumerare microrganismi come batteri e fagi. Questo metodo include striatura, piastratura in profondità e diffusione per la ricerca microbiologica.

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Un ringraziamento speciale a Cori a Sanders Designs IROC per la preparazione di illustrazioni e di Kris Reddi e Bhairav ​​Shah presso la UCLA per la creazione di culture campione e l&#39;assistenza con figure. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

<ol><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).</li>
<li>US Department of Health and Human Services (DHHS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+And+Biomedical+Laboratories+%28BMBL%29%22">Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> (2009).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFields%2C+BN+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).</li>
<li>Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Research+Center+for+Beef+Genetic+Technologies.+In+vitro+detection+and+primary+cultivation+of+bacteria+producing+materials+inhibitory+to+ruminal+methanogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens.</a> Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).</li>
<li>Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+agar+plate+method+for+quantifying+viable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria.</a> BioTechniques. 23, 648-650 (1997).</li>
<li>Karam, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaram%2C+JD+%22Molecular+Biology+of+Bacteriophage+T4%22">Molecular Biology of Bacteriophage T4</a>. , ASM Press. Washington, DC. (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fundamental+Virology%22">Fundamental Virology</a>. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22A+Short+Course+in+Bacterial+Genetics%3A+A+Laboratory+Manual+and+Handbook+for+Escherichia+coli+and+related+bacteria%22">A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).</li>
<li>Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+modification+to+the+Copacabana+method+for+spreading+transformation+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures.</a> BioTechniques. 39, 188(2005).</li>
<li>Jordan, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJordan%2C+T+%22RESEARCH%3A+National+Genomics+Research+Initiative+Phage+Resource+Laboratory+Manual%22">RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual</a>. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning - A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Sanders, E. R., Miller, J. H. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanders%2C+ER+%22Microbiologist%3A+A+Discovery-based+Course+in+Microbial+Ecology+and+Molecular+Evolution%22">Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution</a>. , ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Slonczewski, J. L., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlonczewski%2C+JL+%22Microbiology+-+An+Evolving+Science%22">Microbiology - An Evolving Science</a>. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+Red-Polysaccharide+Interactions+in+Enumeration+and+Characterization+of+Cellulolytic+Bacteria+from+the+Bovine+Rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Wise, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWise%2C+K+%22Preparing+Spread+Plates+Protocols%22">Preparing Spread Plates Protocols</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols">http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols</a> (2006).</li>
<li>Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copacabana+method+for+spreading+E.+coli+and+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies.</a> BioTechniques. 30, 738-742 (2001).</li>
<li>American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/</a> (2012).</li>
<li>EPA Microbiology Home Page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html">http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html</a> (2012).</li>
<li>The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html">http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html</a> (2012).</li>
<li>Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html">http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html</a> (2012).</li>
<li>Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics">http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics</a> (2012).</li>
<li>Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm">http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm</a> (2012).</li>
<li>Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss">http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss</a> (2012).</li>
<li>United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov">http://water.epa.gov</a> (2012).</li>
<li>American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html</a> (2012).</li>
<li>Introductory Course in Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html</a> (2012).</li>
</ol>

Non ho nulla da rivelare.

Coltivare microrganismi comporta un certo numero di metodi di placcatura, le quali richiedono che asepsi essere mantenuta durante tutta la manipolazione di cellule e media. Cinque diverse procedure sono state descritte in questo protocollo. Sebbene queste tecniche di placcatura sono abitualmente utilizzati per manipolare i batteri e fago, possono anche essere applicato a colture cellulari di mammifero e microrganismi eucarioti comunemente usato in genetica molecolare come lievito (cioè, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), alghe e protozoi ( cioè, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) e nematodi (cioè, Caenorhabditis elegans). Ci sono anche numerosi (e ancor più sofisticate) variazioni di ogni metodo di placcatura a seconda dell&#39;obiettivo sperimentale o dell&#39;organismo in fase di studio. Pertanto, è importante non solo selezionare la tecnica più appropriato per un dato microrganismo esperimento o bersaglio, ma anche per adattare il t tale metodologiacappello dei risultati sperimentali adeguatamente affrontare la questione o il problema di ricerca. Alcune delle applicazioni più attuali delle tecniche di placcatura discusse in questo protocollo comporta progressi tecnologici che producono risultati di high-throughput per gli esperimenti di screening e di scoperta della droga. Ad esempio, centri di sequenziamento del genoma utilizzare il &quot;metodo Copacabana&quot; per la diffusione-placcatura librerie di cloni, che sono E. coli trasformate con i plasmidi contenenti i frammenti di DNA derivate dal genoma di un microrganismo. Perché decine di piatti di grandi dimensioni (chiamato vassoi saggi biologici) sono preparati in una sola volta, un sistema automatico agitatore viene utilizzata per agitare le perline in vetro per l&#39;intera partita di vassoi. Inoltre, quando si selezionano le colonie di queste piastre dopo l&#39;incubazione, una raccoglitrice di colonia robotica viene utilizzata per raccogliere le cellule delle colonie appropriate come l&#39;inoculo per brodo LB a 384 e micropiastre. Per questo saggio ad alta prestazione di screening, i principi procedurali di diffusione-ptecnica di ritardo ma la tecnologia consente di applicare vari passi da automatizzare e scalata per consentire un gran numero di campioni da analizzare contemporaneamente e in un breve arco di tempo. Aziende biotecnologiche e farmaceutiche investono considerevoli risorse nello sviluppo di high-throughput tecnologia per le tecniche più basilari di microbiologia e genetica molecolare. Ad esempio, ci sono multi-canale Micropipettatrici per effettuare trasferimenti di volume fino a 8 o 12 campioni alla volta. Ci sono anche stazioni di lavoro robotizzate che manovra a 96 canali testa pipetta! Questi sforzi coinvolgono team multi-disciplinare di scienziati, biologi associazione che possiedono le competenze metodologiche con ingegneri e programmatori di computer che possano sviluppare la strumentazione necessaria per eseguire le operazioni meccaniche associate con gli esperimenti. Qualunque sia l&#39;applicazione di ricerca, l&#39;obiettivo condiviso da aziende che sviluppano queste tecnologie è lo stesso - per automatizzare laboratoriry processi, strumenti, sistemi e strumenti, rendendoli meno manodopera e più efficienti.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Lievito Triptone Agar (YTA)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>Estratto di lievito</td>
			<>2,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Triptone</td>
			<>10,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<>15,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 1000,0 ml</td>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Autoclave a 121&deg; C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 gradi C.
Se prepari le provette per la procedura di colata su piastra, lascia raffreddare l'agar a ~55&deg; C quindi aggiungere 2,0 ml di cicloesimide 50 mg/ml. Erogare asetticamente 18,0 ml di agar fuso per provetta da 18 mm, quindi conservare a 4°C. L'agar si solidificherà e dovrà essere sciolto in una vaporiera o in un forno a microonde prima dell'uso.
2. Sali minimi agar (MSA) + 0,1% (p/v) fonte di carbonio
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<>1,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<>2,14 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<>1,09 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<>0,2 g</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Fonte di carbonio*</td>
			<>1,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Soluzione di sali in tracce**</td>
			<>10,0 ml</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<>15,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 1000,0 ml</td>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Autoclave a 121&deg; C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 gradi C.
* Le fonti di carbonio utilizzate per gli esperimenti presentati nella Figura 13 includono acetammide, lattosio e glicina.
** La soluzione di sali traccia viene preparata in 0,1 N HCl come segue. Viene aggiunto alla base prima della sterilizzazione (autoclave a 121 gradi) C per 20 minuti).
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>FeSO4&boll; 7H2O</td>
			<>300,0 mg</>
		</TR>
		<tr>
			<td>MnCl2&boll; 4H2O</td>
			<>180,0 mg</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<>130,0 mg</>
		</TR>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<>40,0 mg</>
		</TR>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>20,0 mg</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<>1,0 mg</>
		</TR>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<>1000,0 mg</>
		</TR>
		<tr>
			<td>HCl (0,1 N)</td>
			<td>fino a 1000,0 ml</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
3. EHA agar morbido (0,65 % p/v)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<>6,5 g</>
			<td></td>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Triptone</td>
			<>13,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaCl</td>
			<>8,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na Citrato&toro; 2H2O</td>
			<>2,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Glucosio</td>
			<>3,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 1000,0 ml</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Autoclave a 121&deg; C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 gradi C.
4. EHA agar duro (1,2% p/v)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<>12,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Triptone</td>
			<>13,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<> 8,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Na Citrato&toro; 2H2O</td>
			<> 2,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Glucosio</td>
			<> 3,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 1000,0 ml</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Autoclave a 121&deg; C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 gradi C.
5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA agar morbido, 0,5% p/v)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>100 mM CaCl2 stock*</td>
			<td> 1 ml</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>7H9 mezzo liquido: < pulito>**</td>
			<>50 ml</>
		</TR>
		<tr>
			<td>2XTA ***</td>
			<>50 ml</>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Sciogliere 50 ml di 2XTA e lasciarlo raffreddare a ~55°C. Utilizzando una tecnica asettica, aggiungere il CaCl2 e il brodo 7H9 all'agar fuso. Erogare asetticamente 4,5 ml di miscela per provetta da 13 mm e conservare in una provetta da 55 gradi Incubatrice C &#8804; 7 giorni. Raffreddamento MBTA a temperatura ambiente o 4 gradi C causerà la precipitazione del CaCl2 fuori dalla soluzione.
* 100 mM CaCl2. Il materiale madre deve essere conservato a temperatura ambiente per evitare che CaCl2 precipiti fuori dalla soluzione.
** 7H9 mezzo liquido: Intero
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>7H9 base brodo</td>
			<>4,7 g</>
		</TR>
		<tr>
			<>40% di glicerolo</>
			<>5 ml</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 900,0 ml</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Mescola la base con l'acqua, poi aggiungi il glicerolo mescolando. Autoclave a 121 gradi C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 gradi C.
*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>7H9 base brodo</td>
			<>4,7 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<>1,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 1000,0 ml </td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Autoclave a 121&deg; C per 20 minuti per sterilizzare. Erogare aliquote da 50 ml in flaconi da 100 ml e conservare a 4°C. 
6. Piastre Middlebrook 7H10 Agar (agar duro MHA, 1,9% p/v)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>7H10 base di agar</td>
			<>19,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<>40% di glicerolo</>
			<>12,5 ml</cucchiaio>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>887,5 ml</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Mescola la base di agar con acqua, poi aggiungi il glicerolo mescolando. Scaldare la soluzione fino all'ebollizione, quindi mescolare per un minuto per sciogliere completamente la polvere di base. Autoclave a 121 gradi C per 20 minuti per sterilizzare. Lasciare raffreddare l'agar a ~55 gradi C quindi aggiungere asetticamente i seguenti reagenti:
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			Integratore <td>AD (preriscaldato a 37 gradi; C)*</td>
			<td>100 ml</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>50 mg/ml di carbenicillina **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>10 mg/ml di cicloesimide **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
* Supplemento AD
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>NaCl > </TD>
			<td>17 g > </TD>
		</TR>
		<tr>
			<td>Albumina (Frazione V)> </TD>
			<td>100 g> </TD>
		</TR>
		<tr>
			<td>Destrosio (D-Glucosio)> </TD>
			<td>40 g> </TD>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata> </TD>
			<td>fino a 2000.0 ml> </TD>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Filtra-sterilizza questa soluzione; Non sterilizzare in autoclave. Conservare a 4 gradi C.
** Filtra-sterilizza e conserva queste soluzioni a 4 gradi; C per &le; 60 giorni.
7. LB agar (1,5% p/v) + X-Gal (60 &mu; g/ml)
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>Triptone</td>
			<>10,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Estratto di lievito</td>
			<>5,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<>10,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<>15,0 g</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acqua distillata</td>
			<td>fino a 1000,0 ml</td>
		</TR>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,5 a 25&deg; C</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Autoclave a 121&deg; C per 20 minuti per sterilizzare. Lasciare raffreddare l'agar a ~55 gradi C quindi aggiungere asetticamente 3,0 ml di soluzione di X-Gal 20 mg/ml. Preparare il brodo X-gal sciogliendo 400 mg di X-GAL in 20 ml di dimetilformammide (DMF). 
Tabella dei reagenti specifici:
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>Nome del reagente</td>
			<td><forte>Azienda</forte></td>
			<td>Numero di catalogo</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Estratto di lievito</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<>212750</>
		</TR>
		<tr>
			<td>Triptone</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>211705</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>214030</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>123340010</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<>30435</>
		</TR>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 303-500</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391 </td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Acetammide</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>A-0500</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Lattosio</td>
			<td>Fisher Scientific </td>
			<td>L6-500 </td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Glicina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7126</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>FeSO4&boll; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8048</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>MnCl2&boll; 4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3634</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230375</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>213621000</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>209198 </td>
		</TR>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016 </td>
		</TR>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Cicloesimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>038K1561</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-100-RG</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Na Citrato&toro; 2H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S279-500</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Glucosio (destrosio)</td>
			<td>BD</td>
			<td>215530</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>7H9 base brodo</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>7H10 base di agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Glicerolo</td>
			<td>Shelton</td>
			<td>IB15760</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Albumina (Frazione V)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S71907</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&#946;-D-galattopiranoside) </td>
			<td>Teknova</td>
			<td>X1205</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Dimetilformammide (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CDA19</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Candeggina al cloro</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>02490/06644884</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>CiDecon (disinfettante)</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<>8504</>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo>
Tabella delle attrezzature specifiche:
<bordo della tabella="1">
	< corpo>
		<tr>
			<td>Nome dell'attrezzatura</td>
			<td><forte>Azienda</forte></td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Esperimento</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Anelli di metallo</td>
			<td>Prodotti educativi americani</td>
			<td>S17352</td>
			<td>Striatura a strisce</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Passanti in plastica monouso</td>
			<td>Fisher</td>
			<>22-363-602</TD>
			<td>Striatura a strisce</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Bastoncini di legno</td>
			<td>Fisher</td>
			<>23-400-104</TD>
			<td>Striatura a strisce</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Stuzzicadenti piatti</td>
			<td>Prodotti educativi americani</td>
			<td>S67859</td>
			<td>Striatura a strisce</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Gira le tavole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-758Q</td>
			<td>Spalmatura</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Canne di vetro</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>NC9004380</td>
			<td>Spalmatura</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>4 mm perle di vetro</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-312B</td>
			<td>Spalmatura</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Panno di vellutino</td>
			<td>Bel-Art Prodotti</td>
			<td>09-718-2</td>
			<td>Replica di placcatura</td>
		</TR>
		<tr>
			<td>Blocco cilindrico</td>
			<td>Bel-Art Prodotti</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td>Replica di placcatura</td>
		</TR>
	</tbody>
</tavolo></td></tr></tbody></table>

tecniche di laboratorio asettico: metodi placcatura

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

I microrganismi sono presenti su tutte le superfici inanimate creazione di fonti di possibile contaminazione onnipresenti in laboratorio. Successo sperimentale si basa sulla capacità di uno scienziato per sterilizzare le superfici di lavoro e attrezzature, nonché prevenire il contatto degli strumenti sterili e soluzioni con superfici non sterili. Qui vi presentiamo i passaggi per la placcatura di diversi metodi comunemente impiegati in laboratorio per isolare, propagare, o elencare i microrganismi come batteri e fagi. Tutti e cinque i metodi di incorporare una tecnica asettica, o procedure che consentono di mantenere la sterilità dei materiali sperimentali. Procedure descritte includono (1) streak-placcatura colture batteriche per isolare singole colonie, (2) pour-placcatura e (3) spread-plating per enumerare vitali colonie batteriche, (4) overlay agar morbide per isolare fago e le placche enumerare, e ( 5) replica-placcatura per trasferire le cellule da una piastra all&#39;altra in un identico modello spaziale. Queste procedure possono essere eseguite a tegli banco di laboratorio, a condizione che coinvolgono non-ceppi di microrganismi patogeni (Biosafety Level 1, BSL-1). Se si lavora con BSL-2 organismi, allora queste manipolazioni devono avvenire in un armadio biosicurezza. Consulta l&#39;edizione più recente del biosicurezza nei laboratori microbiologici e biomedici (BMBL), così come il materiale Schede di Sicurezza (MSDS) per le sostanze infettive di determinare la classificazione di rischio biologico, nonché le precauzioni di sicurezza e le strutture di contenimento necessari per il microrganismo in questione. Ceppi batterici e le scorte di fagi possono essere ottenute da investigatori di ricerca, aziende e collezioni particolari tenuti da organizzazioni come l&#39;American Type Culture Collection (ATCC). Si raccomanda di non utilizzare i ceppi patogeni per imparare i metodi di placcatura vari. Seguendo le procedure descritte in questo protocollo, gli studenti dovrebbero essere in grado di: <ul><li> Eseguire le procedure di placcatura senza contaminating supporti. </li><li> Isolare singole colonie batteriche dalla striscia-plating metodo. </li><li> Utilizzare pour-placcatura e la diffusione-plating metodi per determinare la concentrazione di batteri. </li><li> Effettuare sovrapposizioni agar morbidi quando si lavora con fago. </li><li> Trasferire le cellule batteriche da un piatto all&#39;altro utilizzando la replica-plating procedura. </li><li> Dato un compito sperimentale, selezionare il metodo appropriato di placcatura. </li></ul>

Quando si lavora con i media e dei reagenti utilizzati per i microrganismi cultura, tecnica asettica deve essere praticato per garantire la contaminazione è ridotto al minimo. Una varietà di metodi di placcatura sono abitualmente utilizzati per isolare, propagare o batteri enumerare e fago, tutte che incorporano procedure che consentono di mantenere la sterilità dei materiali sperimentali.

Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

[Narrator] Questo protocollo incorpora la tecnica asettica nei metodi di semina utilizzati per isolare, propagare o enumerare microrganismi come batteri e fagi. Le procedure includono la semina per spiccatura di colture batteriche per isolare singole colonie, la semina in profondità per determinare la concentrazione di batteri e la semina superficiale per enumerare le colonie batteriche vitali. Sovrapposizioni di agar morbido vengono utilizzate per isolare fagi ed enumerare le placche, mentre la semina per replica trasferisce le cellule da una piastra a un’altra mantenendo un identico schema spaziale. In definitiva, le applicazioni pratiche di queste tecniche nella coltivazione di microrganismi spaziano dall'identificazione di batteri in ambienti naturali fino ai progressi tecnologici nel campo della genetica molecolare e nei saggi biologici ad alto rendimento.- In generale, le persone nuove rispetto a questi metodi di semina possono incontrare difficoltà poiché le manipolazioni richiedono movimenti accurati e coordinati, evitando il contatto con superfici non sterili. L'apprendimento di queste procedure di routine richiede formazione ed esercitazione. Le procedure saranno dimostrate dalla coordinatrice del mio laboratorio, la dottoressa Kris Reddi.- [Narratore] Iniziare il lavoro con microrganismi conoscendo le norme di laboratorio e le precauzioni di sicurezza, inclusa la classificazione del rischio biologico, la decontaminazione e lo smaltimento dei rifiuti. Verificare che tutti gli strumenti, le soluzioni e i terreni per le procedure di semina siano sterili. Inoltre, predisporre un'area di lavoro pulita. Pulirla con un disinfettante. Allestire un becco Bunsen collegato a una linea del gas, sistemando le forniture necessarie con i materiali opportunamente etichettati. Procedere quindi a lavare accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. Prima, bagnare le mani con acqua corrente tiepida, quindi applicare e distribuire bene il sapone. Strofinare energicamente le mani generando attrito su tutte le superfici, compresi i pollici, il dorso delle dita, il dorso delle mani e sotto le unghie. Risciacquare quindi accuratamente per rimuovere il sapone residuo e asciugare con tovaglioli di carta prelevati da un erogatore. Infine, utilizzando un tovagliolo di carta pulito, chiudere il rubinetto. La tecnica del piatto a striscia è progettata per isolare colture pure di batteri, o colonie, da popolazioni miste mediante semplice separazione meccanica. Prelevare un piatto in agar da una cella frigorifera a quattro gradi Celsius e preriscaldarlo a temperatura ambiente. Selezionare uno strumento dall'insieme di strumenti disponibili per eseguire la strisciatura del piatto. Assicurarsi che il piatto sia asciutto e privo di condensa sul coperchio. Etichettare il fondo di un piatto in agar lungo il bordo. Una volta raggiunta una certa abilità, utilizzare un singolo piatto per più campioni. Accendere quindi un becco Bunsen per sterilizzare l'ansa metallica. Iniziare a tre-quattro pollici dall'ansa metallica, posizionando il filo nella punta del cono blu, la parte più calda della fiamma del becco Bunsen. Quando il metallo diventa incandescente, spostare il filo in modo che la fiamma si avvicini all'ansa. Per raffreddare l'ansa, toccare il bordo del terreno in agar producendo un suono sfrigolante. Continuare quindi a prelevare l'inoculo sull'ansa. Sollevare la metà inferiore del piatto. Muovere l'ansa avanti e indietro dal bordo al centro nel primo quadrante del piatto. Riposizionare il piatto capovolto sul coperchio. Sterilizzare nuovamente l'ansa metallica. Ruotare la piastra di Petri di 90 gradi. Toccare l'ansa vicino alla fine dell'ultima strisciatura, utilizzando un movimento avanti e indietro, sovrapponendo la metà finale delle strisce nel primo quadrante, quindi spostarsi nel secondo quadrante vuoto. Una volta completato il secondo quadrante, posare il piatto. Ripetere la procedura di strisciatura per il terzo e il quarto quadrante, evitando il contatto con il primo quadrante. Per eseguire la strisciatura con un bastoncino sterile piatto, tenere l'estremità stretta delicatamente tra pollice e anulare con un angolo di 10-20 gradi rispetto al terreno, utilizzando l'estremità larga per eseguire le strisce nei quadranti. Capovolgere il piatto sul coperchio tra un quadrante e l'altro e smaltire correttamente il bastoncino. Procedere quindi all'incubazione dei piatti strisciati capovolti. La tecnica del piatto di versamento permette di enumerare il numero totale di unità formanti colonie sulla superficie e all'interno dell'agar di un singolo piatto. Impostare un timer per 10 minuti, quindi trasferire 18 millilitri di terreno in agar fuso da un bagno termico a 55 gradi Celsius a un blocco riscaldante a 48 gradi Celsius e lasciare equilibrare per 10 minuti. Etichettare il fondo di una piastra di Petri sterile. Se applicabile, includere il fattore di diluizione. Ora dispensare 1 millilitro di campione al centro della piastra di Petri. Chiudere il coperchio. Rimuovere il tappo dal tubo di agar fuso e passare il bordo del tubo aperto attraverso la fiamma. Versare con attenzione l'agar nella piastra di Petri. Chiudere il coperchio e quindi mescolare il campione con l'agar ruotando delicatamente la piastra. Attendere 30 minuti per permettere all'agar di solidificarsi. Una volta solidificato l'agar, capovolgere e posizionare la piastra in un ambiente caldo. La tecnica della semina a strato sottile mira a separare i microrganismi contenuti in un piccolo volume di campione, distribuendo le colonie risultanti uniformemente sulla superficie dell'agar. Portare un piatto a temperatura ambiente ed etichettarlo opportunamente. Posizionare il piatto sul giradischi. Pipettare 0,1 millilitri di campione al centro dell'agar e chiudere il coperchio. Espellere il becco in un contenitore per rifiuti. Immergere l'asta metallica in un becher contenente etanolo al 70%, coprendo tutta la parte inferiore dello spargitore e il primo pollice dello stelo, quindi farlo sgocciolare. Accendere l'eccesso di etanolo passandolo attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Successivamente, aprire il coperchio del piatto in agar e raffreddare lo spargitore toccandolo sull'agar lungo il bordo vicino al bordo. Ruotare lentamente il giradischi. Tenendo delicatamente lo spargitore sulla superficie dell'agar, distribuire gradualmente il campione uniformemente su tutto il piatto con un movimento avanti e indietro mentre il giradischi ruota. Chiudere il coperchio e lasciare assorbire il campione per almeno cinque minuti. Quindi, incubare il piatto capovolto. Prima, etichettare correttamente il piatto in agar. Aprire il coperchio del piatto in agar. Poi aprire il contenitore di perline di vetro pre-sterilizzate e passare il bordo attraverso la fiamma. Dispensare con attenzione 10-12 perline di vetro sterili su un piatto in agar. Chiudere il coperchio del piatto e passare il bordo del contenitore delle perline di vetro attraverso la fiamma prima di riposizionare il tappo. Ora, pipettare il campione al centro dell'agar. Con un movimento orizzontale, agitare delicatamente le perline sulla superficie dell'agar sette volte. Se eseguito correttamente, la procedura produce un suono simile a quello di maracas. Ruotare il piatto di 60 gradi e agitare orizzontalmente nuovamente sette volte. Ancora, ruotare il piatto di 60 gradi e ripetere l'agitazione. Verificare che il campione sia stato assorbito. Quindi, versare le perline contaminate in un becher di raccolta contrassegnato contenente ipoclorito di sodio al 10%. Incubare il piatto capovolto. Il saggio delle placche è comunemente usato per rilevare e quantificare i batteriofagi. Coltivare i batteri indicatore in fase esponenziale e conservarli sul ghiaccio. Quindi, etichettare due microprovette sterili rispettivamente come fago e controllo, aggiungendo 50 microlitri di campione di fago o tampone a ciascuna. Successivamente, agitare delicatamente la coltura batterica nel flacone, trasferire un'aliquote di batteri in una provetta sterile e vorticare delicatamente i batteri indicatore, quindi aggiungere 500 microlitri di batteri a ciascun tubo di assorbimento. Mescolare agitando delicatamente le provette. Mai vorticare o pipettare vigorosamente i campioni di fago. Incubare la miscela di fago e batteri a una temperatura appropriata per il ceppo indicatore per 20 minuti. Nel frattempo, trasferire due provette di agar morbido da un bagno termico a 55 gradi Celsius a un blocco riscaldante a 48 gradi Celsius. Lasciare equilibrare per 10 minuti. Etichettare due piastre di agar duro nutriente prive di condensa, pre-equilibrate a temperatura ambiente. Rimuovere una provetta di agar morbido dal blocco riscaldante e verificare che il contenuto non sia troppo caldo al tatto. Successivamente, trasferire in modo asettico la miscela dal tubo di assorbimento del fago alla provetta di agar morbido. Quindi, ruotare rapidamente tra i palmi per mescolare il contenuto. Tenendo la provetta in una mano, aprire il coperchio della piastra di agar duro con l'altra mano. Versare immediatamente l'intero contenuto della provetta sulla superficie di una piastra di agar duro. Oscillare rapidamente e delicatamente la piastra. Chiudere il coperchio e posizionare la piastra in piano per 30 minuti fino a quando l'agar morbido si solidifica. Successivamente, ripetere la procedura per il tubo di assorbimento del controllo, trasferendo la miscela di controllo in una provetta di agar morbido. Mescolarla, versarla su una piastra di agar duro, oscillarla e lasciare solidificare l'agar morbido per 30 minuti. Ispezionare le piastre per la formazione di placche. Per isolare una placca da una miscela eterogenea, perforare con attenzione il centro con un bastoncino sterile e trasferire l'inoculo in una microprovetta sterile contenente 100 microlitri di tampone per fago. Continuare a purificare questo lisato ripetendo il saggio delle placche da tre a sei volte con diluizioni seriali, se necessario. Il trapianto per replica sfrutta un fenotipo selezionabile consentendo il confronto della crescita cellulare su una piastra primaria con piastre secondarie. Tracciare una griglia sul fondo della piastra, etichettare la piastra primaria e numerare i quadrati risultanti. Ora, utilizzare una tecnica asettica per prelevare un bastoncino pre-sterilizzato dal becher, tamponare il centro di ogni quadrato con un campione cellulare e smaltire il bastoncino in un apposito contenitore per rifiuti. Incubare la piastra primaria. Impilare la piastra primaria e tutte le piastre secondarie. Posizionare un segno di orientamento sul lato della metà inferiore delle piastre. Rimuovere quindi un panno di velluto sterile dall'involucro e posizionarlo sul blocco cilindrico. Successivamente, posizionare il supporto allineando i segni sul supporto con quelli sul blocco. Notare il segno di orientamento sul blocco e sul supporto. Rimuovere quindi il coperchio dalla piastra primaria. Allineare i segni di orientamento sulla piastra e sul blocco. Abbassare la piastra in modo che la superficie dell'agar entri in contatto con il panno di velluto. Utilizzando le dita, premere leggermente ma uniformemente sul retro della piastra primaria, quindi sollevarla con attenzione dal blocco. Verificare che l'impronta delle cellule sia visibile sul velluto. Riposizionare il coperchio sulla piastra. Ripetere quindi in sequenza il protocollo sul panno di velluto con ciascuna delle piastre secondarie. Utilizzare l'impronta delle cellule dalla piastra primaria per inoculare fino a otto piastre secondarie, ordinate dalla più sfavorevole alla più favorevole come substrato. Infine, come controllo positivo, per l'ultima piastra della serie, utilizzare un terreno in agar in cui tutti i ceppi testati dovrebbero crescere. Fissare insieme con del nastro le piastre capovolte e incubarle. Ispezionare le piastre secondarie per la crescita. Spegnere il becco Bunsen e quindi riporre tutti gli strumenti. Posizionare l'abbigliamento da laboratorio contaminato, la vetreria e i rifiuti pericolosi nel contenitore di smaltimento appropriato. Pulire l'area di lavoro con disinfettante. Infine, lavare accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. Serratia marcescens è un proteobatterio gram-negativo a forma di bastoncello che produce un pigmento rossastro chiamato prodigiosina. È comunemente trovato in crescita nei bagni e sulle tende della doccia. In questo esempio, la tecnica del piatto a striscia genera singole colonie nel quarto quadrante. Questa analisi dei batteri presenti in un campione d'acqua prelevato da una fontanella pubblica utilizza la tecnica del piatto di versamento. Notare la differenza nell'aspetto delle colonie. Le colonie superficiali sono grandi e di forma circolare, mentre alcune colonie superficiali sono molto piccole e di forma irregolare. La tecnica del piatto a strato sottile è un componente importante negli esperimenti di arricchimento, selezione e screening. Ad esempio, il metodo copacabana è uno strumento differenziante nel classico test bianco-blu in tecnologia del DNA ricombinante. Il fago T4 è un fago a DNA a doppio filamento virulento che infetta il suo ospite Escherichia coli causandone la lisi e il rilascio di fagi progenie. Questo saggio delle placche su agar EHA mostra fagi in zone di chiaro di circa un millimetro di diametro. In assenza di particelle di fago infettante, la crescita batterica produce una sospensione torbida di cellule nell'agar morbido in cui colonie distinte non sono visibili. Nella tecnica del sovraspalmamento con agar morbido, le morfologie delle placche possono variare. Ad esempio, qui lo stesso ceppo ospite di micobatterio produce morfologie di placche distinte in presenza di fagi distruttori di micobatteri rispetto ai fagi micobatterici MSSS. La potenza del trapianto per replica risiede nella capacità di esaminare simultaneamente un gran numero di microrganismi. In questo caso, quattro ceppi di Pseudomonas sono stati testati in duplicato per la crescita su tre diverse fonti di carbonio: acetammide, lattosio e glicina. Qui, la piastra primaria è un mezzo YTA completo inoculato con i quattro ceppi come indicato. I ceppi mostrano schemi di crescita variabili su piastre replica di mezzo minimo MSA arricchito con una singola fonte di carbonio: acetammide, lattosio o glicina. Tutti i ceppi crescono sull'ultima piastra di controllo positivo, confermando che le cellule sono state trasferite su tutte le piastre secondarie di questa serie. La tabulazione di questi risultati ottenuti con il trapianto per replica illustra lo screening simultaneo di diversi ceppi selvatici per specifici requisiti di crescita.- Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire le procedure di semina senza contaminare i terreni o le colture, nonché di come utilizzare il metodo di semina più appropriato per ogni specifico compito sperimentale in laboratorio. L'acquisizione di padronanza di queste tecniche richiede esercitazione. Tuttavia, con un'adeguata formazione, le procedure di semina descritte in questo video diventeranno naturali durante il lavoro al banco del laboratorio.

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