Rilevamento dell'attivazione dell'inflammasoma tramite microscopia a fluorescenza

Per rilevare l'attivazione dell'inflammasoma del recettore NOD-simile P3, o NLRP3, prelevare una piastra multipozzetto contenente macrofagi attivati che esprimono le proteine NLRP3.

Trattare le cellule con terreni contenenti ionofori e glicina. Gli ionofori inducono l'efflusso di ioni potassio, attivando e oligomerizzando le proteine NLRP3. NLRP3 oligomerizzato recluta proteine adattatrici, facilitando il legame della pro-caspasi-1, formando il complesso inflammasoma NLRP3.

Sull'inflammasoma, la prossimità innesca l'auto-scissione della pro-caspasi-1, rilasciando caspasi attive, avviando la piroptosi e la condensazione nucleare. Inoltre, la glicina stabilizza la struttura cellulare, prevenendo la lisi cellulare.

Trattare i macrofagi con sonde reporter fluorescenti contenenti un gruppo legante la caspasi-1 e un fluoroforo collegato tramite una sequenza di amminoacidi. La caspasi-1 attivata riconosce la sequenza di amminoacidi della sonda e si lega al suo gruppo legante la caspasi, consentendone la visualizzazione.

Fissare le cellule e sovrapporle con un colorante fluorescente per colorare i nuclei. Immagine al microscopio a fluorescenza.

Contare i macrofagi con nuclei condensati blu