Rilevamento dell'attivazione dell'inflammasoma tramite microscopia a fluorescenza

Per rilevare l'attivazione dell'inflammasoma del recettore NOD-simile P3, o NLRP3, prelevare una piastra multipozzetto contenente macrofagi attivati che esprimono le proteine NLRP3.

Trattare le cellule con terreni contenenti ionofori e glicina. Gli ionofori inducono l'efflusso di ioni potassio, attivando e oligomerizzando le proteine NLRP3. NLRP3 oligomerizzato recluta proteine adattatrici, facilitando il legame della pro-caspasi-1, formando il complesso inflammasoma NLRP3.

Sull'inflammasoma, la prossimità innesca l'auto-scissione della pro-caspasi-1, rilasciando caspasi attive, avviando la piroptosi e la condensazione nucleare. Inoltre, la glicina stabilizza la struttura cellulare, prevenendo la lisi cellulare.

Trattare i macrofagi con sonde reporter fluorescenti contenenti un gruppo legante la caspasi-1 e un fluoroforo collegato tramite una sequenza di amminoacidi. La caspasi-1 attivata riconosce la sequenza di amminoacidi della sonda e si lega al suo gruppo legante la caspasi, consentendone la visualizzazione.

Fissare le cellule e sovrapporle con un colorante fluorescente per colorare i nuclei. Immagine al microscopio a fluorescenza.

Contare i macrofagi con nuclei condensati blu e focolai fluorescenti verdi della caspasi-1 attivata, suggerendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3.

Iniziare sostituendo il terreno di macrofagi derivati dal midollo osseo innescati con LPS seminati su vetrini coprioggetti con 290 microlitri di terreno DMEM-5 integrato con nigericina 5-micromolare e glicina 5-millimolare per pozzetto. Rimettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore per colture cellulari per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, aggiungendo 10 microlitri di 30X FAM-YVAD-FMK dopo i primi 15 minuti.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con 1 millilitro di PBS freddo per pozzetto tre volte per 5 minuti per lavaggio, e fissare le cellule con 250 microlitri di paraformaldeide al 2% per pozzetto per 30 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce, etichettando le cellule con un colorante nucleare fluorescente appropriato durante gli ultimi cinque minuti.

Al termine dell'incubazione, lavare le celle tre volte con PBS freddo come appena dimostrato, e caricare ogni vetrino con 7 microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento. Posizionare un vetrino coprioggetti su ogni vetrino e lasciare indurire il supporto di montaggio durante la notte prima di sigillare i vetrini coprioggetti con lo smalto per unghie.

Per visualizzare le cellule mediante microscopia confocale a fluorescenza, posizionare il vetrino di controllo non trattato sul tavolino del microscopio e mettere a fuoco manualmente le cellule. Utilizzando le impostazioni della tabella di ricerca del microscopio, regolare l'offset fino a quando non si osserva alcun posizionamento positivo della sonda nelle cellule non trattate.

Successivamente, utilizzando un campione trattato con nigericina, individuare un campo che contiene cellule sia positive che negative per la colorazione della sonda e regolare il piano di imaging del canale della sonda sul piano che ha la più alta intensità di colorazione positiva. Quindi, regolare il guadagno fino a quando i fuochi sono visibili nelle cellule con nuclei condensati e ottenere immagini di cinque campi selezionati casualmente per diapositiva con un ingrandimento totale di 100X.