Una tecnica in vitro per studiare la formazione di complessi inflammasomici nei macrofagi

0 visualizzazioni3:06 min • July 8th, 2025

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Inizia con una piastra contenente una coltura di macrofagi primari.

Introdurre il lipopolisaccaride batterico, LPS, che si lega ai recettori toll-like sui macrofagi, innescando la sovraregolazione del dominio pirina della famiglia NLR contenente 3 o NLRP3.

Aggiungere uno ionoforo che media l'efflusso di ioni potassio. La diminuzione del potassio citosolico attiva NLRP3. NLRP3 attivato oligomerizza e induce il reclutamento di una proteina adattatrice, che a sua volta recluta la pro-caspasi-1, formando un inflammasoma.

L'autoproteolisi converte la pro-caspasi-1 in caspasi-1 attiva, che media la morte cellulare infiammatoria o la piroptosi. Il danno al DNA durante la piroptosi porta alla condensazione nucleare.

Fissare le celle e trattare con un detergente per permeabilizzarle.

Aggiungere un anticorpo primario che si lega alla proteina adattatrice associata all'inflammasoma e un anticorpo secondario marcato in fluorescenza che si lega all'anticorpo primario, marcando l'inflammasoma.

Introdurre una colorazione fluorescente di acido nucleico per etichettare il nucleo. Sotto un microscopio a fluorescenza, le cellule mostrano nuclei condensati – che indicano la piroptosi – e focolai di proteine adattatrici – che indicano la formazione di inflammasomi.

Per l'analisi immunofluorochimica delle cellule trattate con nigericina, lavare le cellule marcate con la sonda e incubare le cellule in 250 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione per pozzetto per 30 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce.

Lavare i macrofagi altre tre volte con un tampone di lavaggio fresco e marcare le cellule con 250 microlitri di anticorpo primario contro la proteina speck-like associata all'apoptosi contenente un dominio di reclutamento della caspasi C-terminale, o ASC, per pozzetto per un'ora su ghiaccio.

Lavare le cellule al termine dell'incubazione ed etichettare i campioni con 250 microlitri dell'anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente appropriato per un'altra ora su ghiaccio, aggiungendo 4 microlitri di un colorante nucleare fluorescente appropriato durante gli ultimi 5 minuti.

Dopo aver lavato le cellule 3 volte in tampone di lavaggio a freddo, montare i vetrini coprioggetti sui vetrini con 7 microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento come dimostrato e visualizzare i macrofagi mediante microscopia confocale a fluorescenza.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026