JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:02 min • July 8th, 2025
Prelevare una piastra di analisi contenente macrofagi innescati con lipopolisaccaride.
Il priming aumenta l'espressione dei precursori delle citochine pro-infiammatorie inattive e delle proteine NLRP3.
Aggiungere la nigericina, uno ionoforo di potassio, che favorisce l'efflusso di ioni. Questo interrompe i livelli intracellulari di potassio, innescando le proteine NLRP3, per formare un grande complesso.
NLRP3 oligomerizzato recluta le proteine adattatrici, ASC, causandone la polimerizzazione. I filamenti ASC reclutano la pro-caspasi-1, formando NLRP3-inflammasoma, un complesso multiproteico.
La pro-caspasi-1 subisce un'autoattivazione indotta dalla prossimità, generando la caspasi-1. La caspasi-1 scinde la citochina pro-infiammatoria e la proteina gasdermin-D, creando un poro della membrana plasmatica.
Ciò provoca la secrezione di citochine e la morte cellulare programmata infiammatoria, la piroptosi, il rilascio di contenuti intracellulari, tra cui la lattato deidrogenasi o LDH. Raccogli il surnatante contenente LDH.
Aggiungere la miscela di substrato: lattato, iodonitrotetrazolio viola o colorante INT, NAD+ e diaforasi. L'LDH ossida il lattato a piruvato riducendo il NAD+. La diaforesi catalizza la riduzione dell'INT, formando formazano di colore rosso.
L'intensità del colore corrisponde al rilascio di LDH, con livelli elevati che indicano un aumento del danno cellulare associato alla piroptosi e della morte.
Per eseguire un saggio di rilascio di LDH, aggiungere 50 microlitri di terreno DMEM-5 integrato con 10 micromolari di nigericina a ciascun pozzetto sperimentale e 50 microlitri di DMEM-5 ai pozzetti di controllo spontaneo e al 100% della lisi per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 30 minuti aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi 10x ai pozzetti di controllo della lisi al 100% e aggiungere 10 microlitri di terreno agli altri pozzetti. Al termine dell'incubazione, centrifugare la piastra e trasferire 50 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto in una piastra trasparente a fondo piatto.
Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato appena scongelato e preparato a ciascun pozzetto per un'incubazione di 30 minuti al buio, controllando la piastra dopo 15 minuti per confermare che il segnale non supererà il limite di rilevamento del lettore di piastre. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto in ciascun pozzetto e misurare l'OD490 su un apposito lettore di piastre per consentire il calcolo della percentuale di lisi cellulare per pozzetto.