Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente neutrofili marcati in fluorescenza e trattarli con siero del paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili.

Questi anticorpi interagiscono con i recettori Fc dei neutrofili, attivando una via di segnalazione, producendo specie reattive dell'ossigeno o ROS e attivando la peptidil arginina deiminasi.

I ROS provocano la degranulazione dei neutrofili, rilasciando enzimi - elastasi e mieloperossidasi nel citoplasma. Questi enzimi e la peptidil arginina deiminasi attivata traslocano nel nucleo.

L'elastasi scinde l'istone-H1 e la mieloperossidasi modifica gli istoni, avviando la decondensazione della cromatina. La peptidil arginina deiminasi attivata induce citrullinazione degli istoni, convertendo i residui di arginina in citrullina e contribuendo a un'ulteriore decondensazione.

La cromatina decondensata si mescola con proteine intracellulari, comprese le proteine antimicrobiche e citoplasmatiche. Successivamente, la membrana del neutrofilo si disintegra, rilasciando cromatina decondensata mescolata con proteine citoplasmatiche nello spazio extracellulare, formando una trappola extracellulare per neutrofili, NET.

Aggiungere un colorante di DNA impermeabile alle cellule, che si lega esclusivamente al DNA extracellulare nei NET. Al microscopio a fluorescenza, i neutrofili appaiono rossi con strutture extracellulari verdi simili a ragnatele, confermando la formazione di NET.

Realizzare una sospensione cellulare a una densità di 420.000 cellule per millilitro in terreno RPMI-1640 privo di rosso fenolo contenente il 2% di FCS. Aggiungere 37.500 neutrofili in 90 microlitri a ciascun pozzetto di una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti.

Successivamente, aggiungere 10 microlitri dello stimolo scelto, in triplicato, per raggiungere una concentrazione del 10% in ogni pozzetto. Includi sempre un controllo negativo in triplice copia. Incubare al buio a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato, che varia da 30 minuti a 2, 4 o 6 ore. Quindi, preparare il volume di colorante di DNA impermeabile necessario per aggiungere 25 microlitri di colorante di DNA impermeabile a 5 micromolari per raggiungere una concentrazione finale di 1 micromolare in ciascun pozzetto.

15 minuti prima della fine del tempo di incubazione, aggiungere 25 microlitri di colorante DNA impermeabile a 5 micromolari in ciascun pozzetto. Continuare l'incubazione per gli ultimi 15 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Successivamente, rimuovere il surnatante con molta attenzione e conservarlo se necessario. Aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 4%. Tieni la piastra al buio e procedi immediatamente alla sezione successiva.

Dopo aver configurato le impostazioni, selezionare Serie Z. Selezionare 10 come numero di passaggi. Selezionare 3 micrometri come dimensione del passo. Caricare la piastra nel microscopio confocale a immunofluorescenza.

Fare clic sulla scheda Esegui. Compila il nome e la descrizione della targa e scegli il luogo di stoccaggio. Seleziona i pozzetti che devono essere acquisiti. Scegli il tempo di esposizione per Texas Red e FitC, quindi fai clic su Acquisisci lastra e avvia l'acquisizione, che richiederà circa 1 ora per lastra.

Successivamente, selezionare Macro di analisi. Quindi, selezionare W1 e scegliere il valore di soglia. Quindi, selezionare il valore del pixel desiderato e infine, in una seconda finestra di ImageJ, selezionare W2 e scegliere il valore di soglia con il valore del pixel desiderato. Seleziona una destinazione per il file del foglio di calcolo. Eseguire l'analisi e salvare il file di log in seguito.