Isolamento di lipidi da neutrofili derivati dal sangue umano mediante separazione bifasica

Prendi una provetta di vetro contenente neutrofili omogeneizzati con componenti intracellulari rilasciati.

Aggiungere metanolo, un solvente polare, che interrompe le interazioni lipidi-lipidi e lipidi-proteine. La polarità intrinseca del metanolo distribuisce uniformemente i lipidi polari, solubilizzandoli. Successivamente, aggiungi il cloroformio, un solvente organico non polare, che interagisce con i lipidi non polari, causandone la dispersione e la solubilizzazione.

Centrifugare per separare il pellet contenente proteine dal surnatante contenente lipidi, polisaccaridi e detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un tubo di vetro fresco. Aggiungere il cloroformio e l'acqua distillata. Centrifugare il campione.

L'aggiunta di acqua forma spontaneamente un sistema bifasico, suddividendo le biomolecole all'interno degli strati inferiori di cloroformio e acqua-metanolo superiori.

Lo strato di cloroformio comprende lipidi non polari disciolti, mentre lo strato superiore contiene contaminanti non lipidici e lipidi più polari. Rimuovere lo strato superiore di acqua-metanolo senza disturbare lo strato contenente lipidi.

Utilizzare un concentratore sottovuoto per rimuovere il solvente dai lipidi. Conservare a temperature più basse fino a nuovo utilizzo.

Per isolare i lipidi dai neutrofili derivati dal sangue periferico umano, prendere i neutrofili preparati e metterli sul ghiaccio. Pipettare i neutrofili in una provetta di vetro da 15 millilitri con tappo a vite con guarnizione in PTFE e omogeneizzarli agitando per un minuto. Quindi, aggiungere 2 millilitri di metanolo, seguiti un minuto dopo da 1 millilitro di cloroformio. Dopo aver agitato per un altro minuto, ruotare i tubi di vetro a temperatura ambiente e 50 giri/min per 30 minuti.

Quindi, pellettare la frazione proteica centrifugando la soluzione a 7 gradi Celsius e 1952 volte g per 10 minuti. Decantare con cura il surnatante in un nuovo tubo di vetro da 15 millilitri con tappo a vite, lasciando dietro di sé il pellet contenente proteine. Conservare il pellet a meno 20 gradi Celsius per una futura quantificazione.

Aggiungere 1 millilitro di cloroformio e attendere un minuto. Quindi, aggiungere 1 millilitro di acqua distillata doppia e capovolgere la provetta con tappo a vite in vetro con il campione per 30 secondi. Dopo aver centrifugato il campione come prima, rimuovere e scartare la fase superiore fino allo strato torbido escluso. Essiccare i campioni in un concentratore sottovuoto a 60 gradi Celsius e conservarli a meno 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno.