JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:25 min • July 8th, 2025
Prendi una piastra multipozzetto contenente macrofagi.
Aggiungere Cryptococcus neoformans ai pozzetti di prova, mentre i pozzetti di controllo contengono solo macrofagi.
I macrofagi fagocitano i funghi all'interno dei fagosomi.
Lavare con tampone per rimuovere i funghi non fagocitati. Aggiungere terreni privi di antibiotici. Incubare.
Il fagosoma si fonde con il lisosoma, formando un fagolisosoma. I funghi modulano il pH fagolisosomico e possiedono meccanismi intrinseci per sopravvivere a condizioni fagolisosomiali difficili. I funghi permeabilizzano la membrana fagolisososomiale e si replicano, accompagnati da accumulo citosolico di vescicole piene di polisaccaridi.
La residenza e la replicazione fungina intracellulare causano danni cellulari, innescando vie di morte cellulare. Ciò provoca la lisi dei macrofagi e il rilascio di contenuto intracellulare, inclusa la lattato deidrogenasi o LDH, nei terreni.
Raccogli i media contenenti LDH in momenti diversi. Lisi i macrofagi di controllo in momenti simili per ottenere il massimo rilascio di LDH cellulare. Aggiungere la miscela di analisi al terreno raccolto e ai lisati. L'LDH converte il lattato in piruvato, riducendo il NAD+. La diaforasi riduce il sale di tetrazolio, formando un prodotto rosso di formazan
.Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'assorbanza del formazan per quantificare la lisi dei macrofagi in seguito all'infezione da Cryptococcus neoformans.
Per preparare le cellule fungine a un'infezione da macrofagi, raccogliere e centrifugare le cellule di C. neoformans da una coltura in fase di log intermedio, seguita da tre lavaggi delicati con 1 millilitro di PBS a temperatura ambiente nelle stesse condizioni di centrifuga.
Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule fungine a una concentrazione di terreno di coltura cellulare priva di antibiotici da 1,2 volte 10 a 8 per millilitro, e aggiungere 1 millilitro di sospensione di cellule fungine a ciascuno dei 4 pozzetti di una piastra di coltura di macrofagi confluente al 70-80%. Quindi, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per tre ore. Inclinare con cautela la piastra per consentire a ciascun pozzetto di essere lavato delicatamente tre volte con 1 millilitro di PBS per pozzetto per lavaggio.
Per misurare la competenza nell'infezione dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 1 millilitro di terreno privo di antibiotici a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Nei punti temporali sperimentali appropriati, raccogliere il surnatante da ciascun pozzetto e misurare la quantità di LDH in ciascun pozzetto secondo i protocolli standard. Allo stesso tempo, lisare le cellule macrofagiche non infette per determinare il valore di massima citotossicità.
La citotossicità può quindi essere calcolata utilizzando la formula indicata.