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Prendi un sistema di infezione a due camere separato da un inserto a membrana permeabile. Il compartimento inferiore contiene cheratinociti umani aderenti, o cellule della pelle.
Aggiungere agenti patogeni batterici nella camera superiore e incubare. La membrana impedisce il contatto diretto degli agenti patogeni con i cheratinociti. Gli agenti patogeni secernono streptolisina S o SLS – una piccola tossina – che attraversa la membrana per raggiungere le cellule.
Il co-trasportatore del bicarbonato di sodio sui cheratinociti media l'afflusso di bicarbonato e ioni sodio, mantenendo il pH intracellulare. SLS si lega al co-trasportatore e interrompe il trasporto ionico, portando a stress osmotico intracellulare.
La segnalazione a valle indotta dallo stress provoca la degradazione dell'inibitore legato al fattore nucleare sequestrato-Kappa B, o NF-κB, portando alla sua attivazione. L'NF-κB attivato trasloca nel nucleo, portando alla sovraregolazione della produzione di citochine pro-infiammatorie.
Dopo la secrezione extracellulare, le citochine si legano ai recettori di morte sulla cellula ospite, avviando la necrosi. Dopo l'incubazione, prelevare il surnatante di coltura per valutare l'impatto della tossina batterica.
Immediatamente prima del trattamento, utilizzare 1X PBS per lavare le cellule. Quindi, applicare 2 millilitri di terreno di coltura fresco con o senza trattamento farmacologico alle piastre a sei pozzetti, o 0,5 millilitri di terreno ai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti. Successivamente, sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare una pinza sterile per posizionare con cura un inserto a membrana permeabile sterile da 0,4 micron in ciascun pozzetto.
La manipolazione delicata e sterile degli inserti permeabili durante la preparazione dell'infezione è fondamentale per evitare che la membrana venga compromessa o contaminata durante questo processo.
Applicare un terreno di coltura cellulare fresco nella camera superiore di ciascun pozzetto, secondo le istruzioni del produttore. Quindi, applicare un volume appropriato di colture batteriche normalizzate nella camera superiore del sistema di inserti a membrana permeabile e applicare il mezzo batterico ai pozzetti di controllo.
Un'attenta aggiunta dei batteri alla camera superiore, così come il trasporto delicato delle cellule infette all'incubatore, sono fondamentali, perché è essenziale che i batteri non contaminino la camera inferiore durante la configurazione sperimentale.
Per valutare la presenza di proteine dell'ospite secrete, utilizzare una pinza sterile per rimuovere con cura l'inserto della membrana permeabile. Quindi, senza disturbare il monostrato di cellule, raccogliere il terreno dalla camera inferiore in provette da 1,5 millilitri.
Centrifugare i campioni a 14.000 RCF e 4 gradi Celsius per 10 minuti per pellettare i detriti cellulari. Quindi, rimuovere tutti i microlitri di surnatante tranne 50, trasferirli in un tubo fresco da 1,5 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius, oppure utilizzare immediatamente.