JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:43 min. • July 8th, 2025
Prendi una camera di imaging contenente una coltura di cellule epiteliali umane caricate con un indicatore fluorescente di calcio intracellulare.
Aggiungere un terreno di coltura contenente ioni calcio. Introdurre Shigella, un batterio patogeno, e incubare.
Il sistema di secrezione batterica penetra nella cellula ospite e rilascia gli effettori di invasione. L'invasione innesca il riarrangiamento dell'actina, formando arruffamenti della membrana attorno ai batteri.
Nel sito di invasione, la fosfolipasi C, o PLC, sulla membrana plasmatica viene attivata e i recettori dell'inositolo trifosfato si raggruppano sul reticolo endoplasmatico o ER.
Il PLC idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato di membrana in inositolo trifosfato, o IP3, che si accumula localmente a causa della fitta rete di actina.
IP3 si lega ai recettori sull'ER, causando il rilascio di calcio. Gli indicatori del calcio si legano agli ioni rilasciati ed emettono fluorescenza, mostrando una risposta locale del calcio.
IP3 si diffonde lentamente attraverso l'actina, esaurendo ulteriormente il livello di calcio dell'ER e attivando un canale del calcio della membrana plasmatica, portando all'afflusso di calcio.
La fluorescenza attraverso la cellula indica una risposta globale ritardata al calcio.
Posizionare il vetrino coprioggetti contenente le cellule Fluo-4 in una camera di imaging o con fondo di vetro. Utilizzare il tampone EM per lavare il campione tre volte per rimuovere i composti potenzialmente derivanti dalla lisi cellulare. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone EM. Posizionare la camera su un tavolino per microscopio a fluorescenza invertita, riscaldato a 33 gradi Celsius. Seleziona un campo di microscopia e imposta i parametri di acquisizione, tra cui il tempo di esposizione e il binning, se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4.
Per aggiungere batteri al campione, rimuovere con cura 500 microlitri di tampone EM dalla camera e aggiungere 500 microlitri di sospensione batterica per ottenere un ODfinale di 600 di 0,05. Eseguire immediatamente un'acquisizione o attendere 10 minuti per consentire ai batteri di sedimentare sulle cellule. Al termine del flusso di acquisizione, acquisire un'immagine a contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri che entrano in contatto con le cellule e le increspature della membrana associate ai siti di invasione batterica.
Ripetere la procedura di acquisizione a intervalli che siano compatibili con la durata delle acquisizioni delle immagini, il salvataggio dei file e la selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo. Al termine della procedura di acquisizione, aggiungere al campione, due micromolari dello ionoforo di calcio ionomicina per determinare l'ampiezza massima dei segnali di calcio. Acquisire immagini ogni 3-5 secondi fino a quando il segnale non si stabilizza, di solito per meno di 10 minuti.
Seguire aggiungendo il chelante del calcio EGTA a una concentrazione finale di 10 millimolari per determinare il segnale fluorescente in assenza di calcio. Acquisire immagini ogni 3-5 secondi fino alla stabilizzazione del segnale, di solito per meno di 10 minuti. Eseguire l'analisi delle immagini secondo il protocollo di testo.