JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:00 min. • July 8th, 2025
Prelevare una piastra multipozzetto con cellule staminali mesenchimali, o MSC, in pozzetti selezionati.
Introdurre macrofagi e incubare, facilitando l'interazione MSC-macrofagi nei pozzetti di co-coltura.
Aggiungere lo zimosano, un componente della parete cellulare del lievito, coniugato a un fluoroforo sensibile al pH a tutti i pozzetti.
I recettori scavenger dei macrofagi si legano allo zimosoma, innescando il suo inghiottimento all'interno di un fagosoma, che si fonde con un lisosoma per formare un fagolisosoma.
Un pH acido all'interno del fagolisosoma fa sì che il fluoroforo emetta fluorescenza.
Nei pozzi di co-coltura, le MSC proiettano nanotubi tunneling, o TNT, estensioni citoplasmatiche che fanno da ponte con i macrofagi. I mitocondri delle MSC viaggiano attraverso il TNT per entrare nei macrofagi, aumentando il numero totale di mitocondri funzionali.
Un numero mitocondriale elevato aumenta la produzione di adenosina trifosfato o ATP, che alimenta il fabbisogno energetico per un aumento della fagocitosi.
Registrare l'intensità della fluorescenza nel tempo dagli zimosani internalizzati coniugati con fluorofori.
La co-coltura mostra un aumento della fluorescenza rispetto ai pozzetti con solo macrofagi, indicando un aumento della fagocitosi dei macrofagi mediato dalle MSC.
Aspirare delicatamente il terreno dai pozzetti sperimentali contenenti cellule staminali mesenchimali. Utilizzare una micropipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di sospensioni di cellule macrofagiche trattate e di controllo nei pozzetti sperimentali appropriati secondo il design della piastra e incubare durante la notte come dimostrato. Aggiungere un millilitro di terreno di imaging di cellule vive alla fiala contenente un milligrammo di particelle di zimosano e raccogliere la miscela di particelle di terreno in una provetta di vetro.
Dopo aver risciacquato il flaconcino con un ulteriore millilitro di soluzione per immagini, trasferire il mezzo di imaging risciacquato nella provetta di vetro. Quindi, aggiungere 3 millilitri di soluzione di imaging aggiuntiva per ottenere una sospensione di particelle di zimoso di 0,2 mg/ml. Agitare la sospensione di zymosan utilizzando impulsi rapidi per 30-60 secondi. Quindi, utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare la sospensione con 60 impulsi rapidi. Dopo aver aspirato il terreno, sciacquare i pozzetti sperimentali in pozzetti bianchi per reagenti con 100 microlitri di soluzione di imaging di cellule vive.
Quindi, aspirare la soluzione di imaging delle cellule vive dai pozzetti e aggiungere 100 microlitri di sospensione di zimosano. Aprire il vassoio delle lastre del lettore fluorescente utilizzando l'interfaccia touch-pad. Posizionare il piatto senza coperchio nella teglia con la vaschetta A1, nell'angolo in alto a sinistra. Chiudere la barra utilizzando il touchpad e fare clic sul pulsante verde "Leggi" nel menu in alto.