JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:00 min. • July 8th, 2025
Prendete un topo anestetizzato progettato per esprimere una proteina fluorescente nei neutrofili. Rasare il dorso e creare un taglio circolare. Asportare la pelle tagliata per rivelare la fascia, uno strato di tessuto connettivo sottostante.
Prendi una siringa contenente una sospensione di Staphylococcus aureus, un batterio patogeno, geneticamente modificato per produrre bioluminescenza. Iniettare la sospensione tra la fascia e il tessuto sottostante generando un'infezione localizzata della ferita.
I recettori di riconoscimento dei modelli sulle cellule stromali nella fascia riconoscono i modelli molecolari associati ai patogeni sui batteri. Questo legame induce il rilascio di citochine pro-infiammatorie e chemioattrattivi, con conseguente infiammazione.
I chemioattrattivi reclutano neutrofili circolatori nel sito di infezione. I neutrofili in arrivo inghiottono i batteri in un fagosoma che si fonde con i granuli citoplasmatici, causando il rilascio di peptidi antimicrobici.
La NADPH ossidasi, un complesso enzimatico, si assembla sulla membrana del fagosoma e produce specie reattive dell'ossigeno o ROS. I peptidi antimicrobici e i ROS causano la degradazione batterica.
Come contro-risposta, i batteri secernono fattori di virulenza che permeabilizzano la membrana dei neutrofili, causando la lisi cellulare. I batteri rilasciano anche enzimi per la deposizione di fibrina per evitare la fagocitosi.
La risposta immunitaria porta a un ascesso, una capsula di fibrina contenente cellule batteriche, neutrofili e cellule morte.
Registra la fluorescenza dei neutrofili e la bioluminescenza batterica per visualizzare l'interazione batteri-neutrofili.
Per l'inoculazione dello Stafilococco aureo, riempire una siringa da insulina calibro 28 con 50 microlitri dell'inoculante batterico bioluminescente preparato e utilizzare un dito per tirare di lato il derma dell'animale ferito. Tenendo la siringa quasi parallela al tessuto, inserire lentamente la siringa nel tessuto fino a quando non si avverte un'improvvisa diminuzione della resistenza, che indica la perforazione della fascia.
Con l'ago posizionato al centro della ferita, erogare lentamente l'intero volume dell'inoculante. Verificare che l'inoculante formi una bolla al centro della ferita con perdite o dispersioni minime e rimuovere lentamente la siringa dall'animale. Quindi, riporta l'animale nella sua gabbia con calore e monitoraggio fino al completo recupero.