Una tecnica per la generazione di particelle simili al virus dell'influenza attraverso un sistema di mammiferi

Le particelle simili ai virus, o VLP, imitano la struttura del virus ma mancano di materiale genetico virale, il che le rende non virulente. Le VLP possiedono epitopi antigenici legati alla superficie riconosciuti dalle cellule immunitarie, il che le rende candidati vaccinali ideali.

Per generare VLP dell'influenza ricombinante, prendere i vettori di espressione eucariotica.

Due vettori contengono geni che codificano per l'emoagglutinina, o HA, e la neuraminidasi, o NA, proteine strutturali del virus dell'influenza. Il terzo vettore contiene il gene gag, che codifica per le proteine principali del virus dell'immunodeficienza umana.

Aggiungere un reagente di trasfezione a base di lipidi cationici. Il gruppo della testa lipidica caricata positivamente interagisce con il DNA caricato negativamente, formando un doppio strato attorno ai vettori, generando complessi di trasfezione liposomiale.

Aggiungere complessi su cellule ospiti di mammifero in coltura adatte alla produzione di VLP e incubare. I complessi di trasfezione entrano nelle cellule attraverso l'endocitosi: la membrana del liposoma si fonde con la membrana dell'endosoma per rilasciare i vettori nel citoplasma.

I vettori entrano nel nucleo, portando all'espressione dei geni virali. Dopo la sintesi di HA e NA sul reticolo endoplasmatico, le proteine traslocano sulla membrana plasmatica attraverso la via secretoria.

Le proteine del nucleo vengono sintetizzate nel citoplasma e trasportate al sito di assemblaggio per ancorarsi alla membrana plasmatica. I componenti virali accumulati subiscono l'autoassemblaggio in VLP e gemma dalla cellula ospite.

Raccogliere le VLP rilasciate per l'elaborazione a valle.

Il giorno della trasfezione, preparare le soluzioni di liposomi e DNA secondo le raccomandazioni del produttore. Trasfettare le cellule di DNA con una composizione di DNA di 1:1:2 di HA:NA:Gag e una quantità totale di DNA di 40 microgrammi per matraccio T-150. Ripetere questo passaggio per creare nove palloni T-150 per un volume totale di 200 millilitri.

Successivamente, diluire le soluzioni di DNA e liposomi in terreni di trasfezione privi di siero e senza antibiotici, in modo che ogni pallone contenga un volume totale di 24 millilitri. Rimettere i palloni nell'incubatore e mantenere le cellule nel terreno di coltura di trasfezione fino al giorno del raccolto delle particelle simili a virus o VLP.

Trasferire il surnatante in provette coniche da 15 millilitri per raccogliere la coltura dalle cellule dopo 72-96 ore dopo la trasfezione. Ruotare le celle verso il basso per pellettare i detriti cellulari. Raccogli i surnatanti e filtrali attraverso una membrana dei pori da 0,22 micron.