Misurazione del carico in vivo di batteri che esprimono la luciferasi in una larva di insetto

Per misurare la carica batterica in vivo, iniziare con larve di insetti sterilizzate pre-infettate con Bacillus Calmette-Guérin, o BCG lux. BCG lux è un ceppo BCG di Mycobacterium bovis geneticamente modificato che esprime luciferasi, un enzima che produce bioluminescenza.

Trasferire una larva di insetto in una provetta a matrice lisanti contenente tampone con sfere d'acciaio. Utilizzando un omogeneizzatore, omogeneizzare la larva, rilasciando i componenti intracellulari, compresi i batteri, nel tampone.

Centrifugare la provetta per raccogliere l'omogeneizzato e trasferirla in una provetta luminometrica.

Lavare la provetta della matrice con un tampone contenente detergente per solubilizzare i frammenti cellulari e rilasciare i batteri residui.

Combina le frazioni nello stesso tubo del luminometro e aggiungi il substrato di luciferasi. I substrati entrano nei batteri e interagiscono con gli enzimi luciferasi, con conseguente bioluminescenza. Caricare il tubo in un luminometro e misurare la bioluminescenza.

Il luminometro misura l'intensità della luce emessa e calcola l'unità di luce relativa, o RLU, indicativa del carico in vivo di BCG in una larva di insetto.

Stendere la sospensione omogenata diluita su una piastra di agar contenente piperacillina e incubare per far crescere selettivamente il BCG come colonie distinte. Le colonie sulla piastra rappresentano l'unità formante la colonia, o CFU. Il rapporto RLU/CFU correla la bioluminescenza con la vitalità batterica.

Ogni 24 ore, seleziona casualmente cinque larve infette e usa un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% per sterilizzare delicatamente le superfici larvali. Posizionare le larve singolarmente in provette da due millilitri contenenti 800 microlitri di PBS sterile. Quindi, utilizzare un omogeneizzatore per omogeneizzare le larve per 60 secondi a sei metri al secondo.

Centrifugare le provette di lisi a 3.500 volte g per cinque secondi per rimuovere l'omogeneizzato dai coperchi e decantare accuratamente l'omogeneizzato in cinque provette luminometriche sterili singolarmente. Conservare 100 microlitri di omogenato in una provetta di reazione sterile da 1,5 millilitri. Recuperare l'omogeneizzato rimanente lavando le provette della matrice di lisi con un millilitro di PBST e pipettarle nelle provette del luminometro corrispondenti.

Agitare i tubi del luminometro e misurare la bioluminescenza degli omogeneizzati su un luminometro. Quindi, preparare diluizioni seriali di 10 volte dei 100 microlitri di omogenato riservati in piastre di coltura a 24 pozzetti utilizzando PBST. Pipettare 10 microlitri di diluizione su ciascuna piastra di agar Middlebrook 7H11 e utilizzare uno spandiconcime sterile per la diffusione. Incubare a 37 gradi Celsius per due settimane.

Dopodiché, conta le unità formanti colonie.