Name: Intraspinale trapianto di cellule cervicali targeting per corno ventrale nella Sclerosi Laterale Amiotrofica e le lesioni traumatiche del midollo spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Impara il trapianto intraspinale di cellule precursori neurali nel midollo spinale cervicale per proteggere i motoneuron frenici nei modelli di SLA e lesioni spinali. Questo protocollo dettagliato guida la sopravvivenza cellulare.

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Vorrei ringraziare: tutti i membri del Lepore, Maragakis Rothstein e laboratori di discussione utile; Il Veterans Paralizzato d&#39;America e la Craig H. Neilsen Fondazione per il finanziamento.

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
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<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per gli studi che coinvolgono topi G93A SOD1 e ratti, età e sesso-match degli animali all&#39;interno di un gruppo, e distribuire animali all&#39;interno della stessa cucciolata a gruppi diversi. E &#39;preferibile utilizzare tutti gli animali del sesso stesso per entrambi i modelli di SLA e SIC, perché i processi di malattia possono differire tra maschi e femmine, tuttavia, può anche essere utile avere abbastanza animali da entrambi i sessi per individuare possibili sesso-specifici effetti, come questo fenom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> 0,05% tripsina </td><td> Gibco </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina di soia (opzionale) </td><td> Sigma </td><td> T-6522 </td></tr><tr><td> Acepromazina maleato (0,7 mg / kg) </td><td> Fermentazione Animal Health </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (95 mg / kg) </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina (10 mg / kg) </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> # 11 Feather lama chirurgica </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72044-11 </td></tr><tr><td> Punte di cotone (6 pollici) </td><td> Pescatore </td><td> 23-400-101 </td></tr><tr><td> Rat-pinza dentata </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> Ratto: 11023-15; Mouse: 11042-08 </td></tr><tr><td> Medie imprese primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15012-12 </td></tr><tr><td> Mini primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15000-10 </td></tr><tr><td> Pinza ossivora </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> Ratto: 16121-14; Mouse: 16221-14 </td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 10056-12 </td></tr><tr><td> Ago titolari </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 12502-14 </td></tr><tr><td> Sutura: 4-0 </td><td> Vicryl </td><td> S-183 </td></tr><tr><td> Staples: 9 mm </td><td> Autoclip </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Cucitrice: 9 mm (Reflex # 203-1000) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5000344 </td></tr><tr><td> Pompa acqua calda (T / pompa) </td><td> Gaymar </td><td> P / N 07999-000 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A: 250,0 mg/5.0 ml fiale </td><td> Novartis / Sandimmune </td><td> NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FK-506 </td><td> LC Laboratori </td><td> F-4900 </td></tr><tr><td> Rapamicina </td><td> LC Laboratori </td><td> R-5000 </td></tr><tr><td> Iniettore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> UMP2 </td></tr><tr><td> Micro 4 controller pompa Microsiringa </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> UMC4 </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Kite-R </td></tr><tr><td> 10,0 siringa Hamilton microlitri </td><td> Hamilton </td><td> 80030 </td></tr><tr><td> Aghi Hamilton: 33-gauge, smusso a 45 °, 1 pollice </td><td> Hamilton </td><td> 7803-05 </td></tr><tr><td> Pipette di vetro 20,0 microlitri microcapillare (opzionale) </td><td> Kimble </td><td> 71900-20 </td></tr></tbody></table>

intraspinale trapianto di cellule cervicali targeting per corno ventrale nella sclerosi laterale amiotrofica e le lesioni traumatiche del midollo spinale

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Compromissione respiratoria a causa della perdita dei motoneuroni frenico è una conseguenza debilitante di gran parte delle risorse umane lesioni traumatiche del midollo spinale (SCI) casi 1 ed è la causa ultima di morte nei pazienti con la malattia del motoneurone, sclerosi laterali amiotrofica (SLA) 2. La SLA è una malattia neurologica devastante che è caratterizzata da degenerazione relativamente rapido di neuroni motori superiori ed inferiori. I pazienti alla fine soccombere alla malattia in media 2-5 anni dopo la diagnosi a causa della paralisi respiratoria a causa della perdita dei motoneuroni innnervation frenico del diaframma 3. La stragrande maggioranza dei casi sono sporadici, mentre il 10% sono della forma familiare. Circa il venti per cento dei casi familiari sono legati a mutazioni puntiformi diverse nel Cu / Zn superossido dismutasi 1 (SOD1) del gene sul cromosoma 21 4. Topi transgenici 4,5 e 6 ratti trasporto umano SOD1 mutante geni (G93A, G37R, G86R, G85R) sono stati generati, e, nonostante l&#39;esistenza di altri modelli animali di perdita dei motoneuroni, sono attualmente i modelli più utilizzati altamente della malattia . Lesioni del midollo spinale (SCI) è un insieme eterogeneo di condizioni derivanti da traumi fisici al midollo spinale, con risultato funzionale variabile a seconda del tipo di posizione, e la gravità delle lesioni 7. Tuttavia, circa la metà dei casi umani SCI influenzare regioni cervicale, con conseguente debilitante disfunzioni respiratorie a causa di frenico perdita di neuroni motori e lesioni a discendente assoni respiratorie bulbospinal 1. Un certo numero di modelli animali di SCI sono stati sviluppati, con i più usati e clinicamente rilevanti è la contusione 8. Il trapianto di varie classi di cellule precursori neurali (NPC) è una promettente strategia terapeutica per il trattamento di lesioni traumatiche del SNC e neurodegenerazione, tra SLA e SCI, a causa della possibilità di sostituire neuroprotezione persi o SNC disfunzionale tipi di cellule, fornire e distribuire i fattori gene di interesse 9. Modelli animali di sclerosi laterale amiotrofica e SCI sia possibile modellare molti aspetti clinicamente rilevanti di queste malattie, tra cui la perdita frenico neurone motore e la conseguente compromissione respiratoria 10,11. Al fine di valutare l&#39;efficacia della NPC strategie basate sulla funzione respiratoria in questi modelli animali di sclerosi laterale amiotrofica e SCI, interventi cellulare deve essere specificamente indirizzato alle regioni contenenti terapeuticamente obiettivi importanti come i neuroni motori frenico. Forniamo un protocollo dettagliato per il multi-segmentale, il trapianto intraspinale di NPC nel midollo spinale cervicale materia grigia ventrale dei modelli neurodegenerative come topi G93A SOD1 e ratti, così come i ratti con lesione spinale e topi 11.

Trapianto precursore neurale è una strategia promettente per la protezione e / o la sostituzione di perduti / disfunzionale neuroni motori frenico cervicale nelle lesioni del midollo spinale (SCI) e la malattia del motoneurone, sclerosi laterali amiotrofica (SLA). Forniamo un protocollo per la consegna delle cellule cervicali per corno ventrale del midollo spinale in modelli di roditori della SLA e SCI.

Intraspinale trapianto di cellule cervicali targeting per corno ventrale nella Sclerosi Laterale Amiotrofica e le lesioni traumatiche del midollo spinale

Il compromesso respiratorio dovuto alla perdita di motoneuroni frenici è una conseguenza debilitante di una vasta percentuale di lesioni midollari (SCI) traumatiche umane...

L'obiettivo generale di questa procedura è indirizzare trapianti multisegmentali intraspinali di cellule precursori neurali al midollo spinale cervicale, sostanza grigia ventrale, sia di ratti che di topi. Ciò si ottiene innanzitutto preparando il tipo di cellule precursori neurali di interesse per il trapianto. Successivamente viene eseguita una laminectomia sul midollo spinale in ciascun punto in cui è previsto il trapianto cellulare.Successivamente, le cellule vengono iniettate correttamente nei rispettivi punti e a profondità adeguate, al fine di indirizzare con precisione il rilascio cellulare nell'area del corno ventrale del midollo spinale cervicale. L'ultimo passaggio consiste nel proseguire con la somministrazione di immunosoppressione all'animale fino all'eutanasia, per garantire la sopravvivenza delle cellule trapiantate nel midollo spinale. In definitiva, è possibile ottenere risultati per il monitoraggio della sopravvivenza, migrazione e differenziazione delle cellule precursori neurali trapiantate nel midollo spinale cervicale adulto in diversi punti temporali successivi al trapianto, mediante metodi istologici come l'immunohistochimica e l'analisi successiva al microscopio.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché molte delle complesse fasi chirurgiche sul midollo spinale e di trapianto cellulare sono difficili da apprendere, in quanto richiedono grande attenzione e tecniche specifiche, e risultano più agevoli se si seguono le procedure raccomandate. Tre giorni prima del trapianto, immunosopprimere l'animale somministrando iniezioni giornaliere di 10 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di ciclosporina A mediante iniezione sottocutanea. Se si prevede di trapiantare cellule di origine rodentistica, somministrare un milligrammo per chilogrammo di peso corporeo sia di FK506 che di rapamicina mediante iniezione intraperitoneale.Se devono essere trapiantate cellule di origine umana, modellare anche fermagli di carta robusti per formare dei retrattori. Spezzare una parte del fermaglio per creare un gancio e piegare l'altra estremità del fermaglio in un piccolo anello. Quindi far passare un filo attraverso l'anello di ciascun retrattore, e sterilizzare in autoclave i retrattori e tutti gli strumenti da utilizzare durante l'intervento chirurgico nel giorno dell'intervento.Preparare aliquote di cellule progenitrici gliali o altre cellule da trapiantare seguendo le procedure descritte nel protocollo scritto. Una volta raccolte le cellule, distribuire le sospensioni cellulari in più tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro e mantenere su ghiaccio bagnato. Successivamente, dopo aver somministrato un appropriato metodo di anestesia all'animale, verificare che sia stato raggiunto un livello anestetico adeguato per l'intervento chirurgico eseguendo un test di pizzicamento del dito del piede.Utilizzare un rasoio elettrico per rasare la schiena dell'animale, rasando accuratamente una zona che va leggermente al di sopra delle orecchie fino alla metà della schiena e rimuovendo i peli tagliati dalla pelle per evitare che entrino nella ferita chirurgica. Successivamente, inumidire un pezzo di garza con soluzione antisettica a base di povidone iodio ed applicarla sulla pelle nell'area rasata. Procedere con almeno due passaggi di strofinamento con la soluzione antisettica e due passaggi con alcol o disinfettante diluito, seguendo un movimento circolare.Partendo dal sito dell'incisione e procedendo verso l'esterno fino alla linea dei capelli. Posizionare un tampone di garza sterile arrotolato su un supporto chirurgico pulito e fissare il tampone al supporto con del nastro in modo che non si muova. Posizionare l'animale sopra la garza arrotolata in posizione fetale.Stendere entrambe le braccia dell'animale sulla stecca e quindi fissare le braccia alla stecca e alla tavola chirurgica per sollevare il midollo spinale cervicale. Questo renderà più agevole l'intervento chirurgico, poiché il midollo cervicale si trova in profondità al di sotto della superficie della pelle. Durante questa procedura deve essere utilizzato un campo operatorio sterile, anche se ciò non viene mostrato nel video per scopi dimostrativi.Per prima cosa, osservando attraverso un microscopio chirurgico impostato sull'ingrandimento più basso, utilizzare un bisturi sterile affilato per eseguire un'incisione mediana dalla base del cranio alla scapola. Quindi praticare un'incisione attraverso i tre strati muscolari sovrastanti la colonna vertebrale. Applicare una pressione sufficiente per tagliare tutti gli strati muscolari con il minor numero possibile di incisioni, ma non premere troppo perché ciò potrebbe causare danni ai tessuti più profondi usando due applicatori di cotone.Utilizzare un movimento rotatorio per separare il muscolo sovrastante dal muscolo paravertebrale. Non tagliare né lacerare il muscolo, poiché ciò causerebbe emorragia. Posizionare quattro dei retrattori artigianali per retrarre il muscolo.Quindi tirare ciascuno dei quattro retrattori verso i quattro angoli e fissare i fili al supporto per bloccare il retrattore. L'esposizione finale deve avere una forma quadrata o rettangolare. Utilizzare pinze a denti da ratto e forbici a molla di dimensioni medie per rimuovere il muscolo paravertebrale dalla superficie dorsale delle vertebre.Effettuare tagli molto vicini all'osso per esporre meglio la superficie ossea. Assicurarsi che i tagli siano paralleli alla superficie delle vertebre, ma senza tagliare il midollo spinale. Sostituire le forbici a molla di media grandezza con un aratro grezzo.Quindi fissare l'intera colonna vertebrale afferrando il muscolo sopra il processo C2 con pinze a denti da ratto ed usare il bisturi per allontanare il muscolo a livello di C4, C5 e C6. Successivamente, iniziare una laminectomia a C5. Ancora una volta, fissare l'area tenendo C2 con pinze a denti da ratto.Afferrare l'intera lamina con la pinza grezza e posizionare la parte grezza in modo che lo strumento sia perfettamente perpendicolare all'asse della colonna vertebrale. Schiacciare lentamente e delicatamente la lamina senza premere verso il basso nel midollo spinale. Quindi tirare delicatamente verso l'alto il frammento osseo spezzato.Successivamente, posizionare il bisturi cruento perpendicolarmente alla colonna vertebrale. Quindi inserire delicatamente il bisturi cruento sotto l'osso con un angolo compreso tra 30 e 60 gradi rispetto alla superficie del midollo spinale. Praticare piccole incisioni per estendere la laminectomia a tutte le lamine da C4 a C6.Non estendere la laminectomia troppo lateralmente poiché ciò potrebbe causare emorragia. Aumentare l'ingrandimento del microscopio fino a circa 15 x e mettere a fuoco sul midollo. Utilizzare uno strumento dritto e affilato.Usare pinze n. 5 per rimuovere il tessuto connettivo sovrastante la dura. Successivamente, utilizzare forbici a molla miniaturizzate o un microbisturi per incisionare la dura parallelamente all'asse della colonna vertebrale. Partendo da un punto appena mediale rispetto alla zona di ingresso dei radicoli dorsali, assicurarsi che la dura venga perforata nel sito previsto per l'iniezione.Dopo aver forato, il liquido cerebrospinale durerale fuoriuscirà, asciugare la superficie del midollo e tutta l'area esposta con garza o un applicatore con punta di cotone. Utilizzare una pinzetta per afferrare e sollevare leggermente la dura dal midollo spinale senza schiacciare o danneggiare il midollo spinale. Prolungare leggermente l'incisione lungo l'asse cordale rostrale utilizzando una siringa con ago rimovibile da 10 microlitri del tipo Hamilton gast.Dotato di un ago metallico Hamilton con bevel a 45 gradi e calibro 33 affilato. Caricare lentamente il volume richiesto di sospensione cellulare per un sito di iniezione. Abbassare la punta dell'ago verso la superficie dorsale del midollo spinale, monitorandone l'avanzamento attraverso il microscopio.Allineare la siringa con l'asse della colonna vertebrale per mirare correttamente alla regione anatomica desiderata, orientando l'ago il più vicino possibile a 90 gradi e appena medialmente rispetto alla zona di ingresso dei radicoli dorsali. Toccare delicatamente la superficie del midollo spinale con la punta dell'ago, premendo leggermente il midollo spinale con la punta dell'ago. Quindi ritirare l'ago fino a quando il midollo spinale non torna alla posizione normale.Registrare questa posizione come Z uguale a 0,0 utilizzando il righello sul micromanipolatore. Successivamente, monitorando visivamente l'avanzamento attraverso il microscopio, abbassare leggermente l'ago nel midollo spinale. Abbassare l'ago di 1,5 millimetri per colpire il corno ventrale in un ratto adulto.Lasciare l'ago in posizione per due o cinque minuti prima di iniziare l'iniezione. Assicurarsi che l'allestimento chirurgico rimanga inalterato durante questo periodo. Successivamente, iniettare due microlitri di cellule in due o cinque minuti a velocità costante utilizzando il controllo della pompa; dopo l'iniezione, lasciare l'ago in posizione per due o cinque minuti.Estrarre quindi con attenzione l'ago dal midollo spinale. Ripetere il processo di iniezione per altri siti bersaglio. Dopo aver iniettato tutti i siti bersaglio, riportare il microscopio alla minima ingrandimento e suturare.Chiudere contemporaneamente tutti e tre gli strati muscolari sovrapposti con punti di sutura di calibro zero, effettuando tre punti lungo l'asse rostrale del cordone. Chiudere la pelle con clip per ferite da nove millimetri, assicurandosi che le clip siano distanziate circa 0,5 centimetri l'una dall'altra. Stringere le clip con pinze da ago per impedire all'animale di rimuoverle prima della completa guarigione della ferita.Applicare la soluzione antisettica allo iodopovidone sull'area della ferita chirurgica con garza imbevuta e lasciare l'animale riprendersi dall'anestesia su un tappetino riscaldante a circolazione d'acqua. Continuare le iniezioni quotidiane di ciclosporina A o FK506 e rapamicina fino all'eutanasia. Sono arrivati 50.000 topi. Cellule progenitrici gliali sono state trapiantate nel corno ventrale del midollo spinale al livello C4 in un ratto SOD1G93A.Questa immagine mostra che M due topi positivi sono arrivati, le cellule trapiantate sono sopravvissute a un mese dal trapianto e che le cellule si sono localizzate nella sostanza grigia ventrale, ma il sito di iniezione ha mancato medialmente il corno ventrale laterale come indicato dalla linea tratteggiata. Come si può vedere qui, l'iniezione di un numero molto elevato di cellule in questa regione provoca danni al sito di iniezione e lungo il percorso dell'ago. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 45-60 minuti per sei siti di iniezione, se eseguita correttamente.

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Il trapianto di cellule staminali neurali del mouse (NSC) nel midollo spinale di topi con demielinizzazione stabilito è dettagliata. La preparazione del NSC, la laminectomia della vertebra toracica 9 (T9), e il trapianto di NSC si delinea con l'assistenza pre-e post-operatoria dei topi.

Il trapianto chirurgico di cellule staminali neurali del mouse nel midollo spinale di topi infettati con virus dell&#39;epatite neurotropi mouse

Fonte: Zweckberger, K., et al. Uso sinergico di cellule precursori neurali e peptidi autoassemblanti nella lesione sperimentale del midollo spinale cervicale.  J. Vis. Exp. (2015).Questo protocollo dimostra un approccio iniettivo mirato per la riparazione delle lesioni del midollo spinale in un modello di ratto. Prevede la somministrazione di peptidi autoassemblanti (SAP) nel nucleo della lesione per creare un'impalcatura di supporto, seguita da iniezioni di cellule precursori neurali (NPC)...

Iniezione di peptidi autoassemblanti e cellule precursori neurali per la riparazione del midollo spinale in un modello di ratto

Matrici di fibrina che contengono fattori di crescita sono stati usati per mantenere le cellule staminali neurali innestate nei siti di completo recisione del midollo spinale. Cellule trapiantate completamente riempite la cavità della lesione e differenziate in diversi tipi di cellule neurali, tra cui i neuroni che si estendevano assoni nel midollo spinale ospite su lunghe distanze.

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Il trattamento della lesione del midollo spinale cervicale sia con peptidi autoassemblanti (SAP) che con cellule precursori neurali (NPC), insieme a fattori di crescita, è un approccio promettente per promuovere la rigenerazione e il recupero. Viene stabilito un modello di ratto con clip per contusione/aneurisma da compressione di lesione spinale cervicale e un trattamento combinato che prevede l'iniezione di SAP e il trapianto di NPC.

Utilizzo sinergico delle cellule neurali e precursori peptidi autoassemblanti in Sperimentale Cervical Spinal Cord Injury

Lesioni del midollo spinale è una condizione traumatica che provoca grave morbilità e mortalità elevata. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un modello contusione di lesioni del midollo spinale nei topi seguita da un trapianto di cellule staminali neurali.

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Strategie sperimentali per colmare grandi lacune tessuto nel midollo leso spinale dopo acuta e cronica Lesione

Questo articolo descrive una tecnica per inserire un cavo condotto tra i ceppi del midollo spinale dopo il transection completo e riempimento con cellule di Schwann (SCs) e matrice di iniettabili della membrana basale al fine di colmare e promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap.

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In questo studio, sono stati sviluppati e caratterizzati idrogel compositi nervo-mimetici che possono essere utilizzati per studiare e capitalizzare il comportamento pro-rigenerativo delle cellule staminali di derivazione adiposa per la riparazione delle lesioni del midollo spinale.

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Intraspinale trapianto di cellule cervicali targeting per corno ventrale nella Sclerosi Laterale Amiotrofica e le lesioni traumatiche del midollo spinale (Video) | JoVE Journal

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