Una tecnica per valutare la localizzazione in vivo di anticorpi specifici per il tumore

Prendi una sospensione di cellule di cancro ovarico umano. Aggiungere un mezzo di matrice a membrana basale e tenere sul ghiaccio per evitare la formazione di gel.

Caricare la miscela in una siringa e iniettarla per via sottocutanea in un topo nudo atimico. Rimuovere l'ago una volta che la matrice subisce la gelificazione, impedendo l'espulsione della miscela.

La mancanza di una risposta immunitaria nel topo immunodeficiente preserva la vitalità delle cellule iniettate. Le proteine della matrice extracellulare e i fattori di crescita del gel forniscono segnali che promuovono la crescita, facilitando la formazione del tumore.

Le cellule tumorali sovraesprimono il recettore alfa-1 dei folati legato in superficie, o FOLR1.

Assumere anticorpi specifici per FOLR1. Aggiungere un colorante fluorescente e incubare, consentendo la coniugazione del colorante con gli anticorpi.

Iniettare per via endovenosa gli anticorpi marcati nel topo anestetizzato portatore di tumore.

Gli anticorpi raggiungono il tumore attraverso la circolazione e si legano a FOLR1 sulle cellule tumorali, marcando in modo fluorescente la superficie cellulare.

Eseguire l'imaging a fluorescenza in vivo. Dopo l'eccitazione, il colorante emette fluorescenza, facilitando la valutazione della localizzazione degli anticorpi nel tumore.

Dializzare 0,5 millilitri di anticorpo utilizzando una cassetta per dialisi in 1 litro di tampone di coniugazione. Dopo quattro ore, trasferire la cassetta per dialisi in un tampone fresco e dializzare durante la notte. Per impostare una reazione di coniugazione, aggiungere 0,03 microgrammi di IRDye 800CW per 1 milligrammo di anticorpo in un volume totale di 500 microlitri.

Incubare la miscela per due ore a 20 gradi Celsius. Quindi, purificare i coniugati marcati mediante dialisi estesa contro la PBS. Stimare il grado di marcatura misurando l'assorbanza del colorante a 780 nanometri e l'assorbanza della proteina a 280 nanometri.

Per sviluppare xenotrapianti di topo, sollevare delicatamente la pelle dell'animale e separarla dallo strato muscolare sottostante. Iniettare lentamente 100 microlitri di sospensione cellulare sotto la pelle con un ago calibro 26. Attendere qualche secondo prima di estrarre l'ago in modo che il terreno della matrice basale possa formare una struttura semisolida simile a un gel insieme alle cellule sotto la pelle, che impedirà alla miscela di fuoriuscire dal sito di iniezione.

Per eseguire l'imaging in vivo, iniettare l'anticorpo marcato con il colorante attraverso la vena caudale. Dopo aver anestetizzato il topo, verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale e dilatare la vena applicando acqua tiepida. Utilizzare una siringa da insulina da 1 CC con un ago calibro 26 per iniettare 25 microgrammi dell'anticorpo marcato in un volume di 100 microlitri. Come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo dell'isotipo IgG non specifico che non ha come bersaglio le cellule tumorali.

Eseguire l'imaging in vivo 8, 24 e 48 ore dopo le iniezioni di anticorpi. Nel software di imaging, fare clic su Inizializza. Verificare che la temperatura del palco sia di 37 gradi Celsius. Nel pannello di controllo, impostare l'imaging a fluorescenza tramite la procedura guidata di imaging e impostare l'eccitazione a 773 nanometri e l'emissione a 792 nanometri.

Trasferire il topo anestetizzato nella camera di imaging e posizionarlo sul campo di imaging utilizzando il cono del naso. Quando si è pronti, fare clic su Acquisisci nel pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine, quindi fare clic su Esposizione automatica. L'immagine generata è la sovrapposizione della fluorescenza sull'immagine fotografica, con l'intensità della fluorescenza ottica visualizzata in unità di conteggio o fotoni.