Monitoraggio dell'arrivo di proteine di superficie marcate con GFP nella rete trans-Golgi utilizzando nanocorpi funzionalizzati

Inizia con cellule tumorali prive di solfato che esprimono una proteina di superficie marcata con GFP.

Aggiungere solfato radiomarcato e nanocorpi anti-GFP modificati, un anticorpo a catena singola che trasporta un motivo di solfatazione tirosina, e incubare.

Le cellule prive di solfato internalizzano i solfati radiomarcati, incorporandoli nei componenti cellulari.

Il nanocorpo anti-GFP si lega alla proteina di superficie marcata con GFP e viene endocitosizzato in una vescicola. Questa vescicola trasporta il complesso proteico nanocorpo-superficie lungo specifici percorsi intracellulari, tra cui la rete trans-Golgi, o TGN.

All'interno del TGN, la sulfotransferasi in presenza di un substrato trasferisce un solfato radioattivo a specifici residui di tirosina sul nanocorpo, radiomarcandolo.

Lavare le celle. Quindi, lisare le cellule.

Centrifugare il lisato per rimuovere i detriti cellulari di grandi dimensioni. Isolare i nanocorpi utilizzando un metodo di purificazione a base di perle di nichel.

Caricare la frazione isolata su un gel SDS-PAGE per separare il nanocorpo radiomarcato in bande distinte.

Sottoporre il gel ad autoradiografia.

L'autoradiografia risultante rivela regioni scur