Utilizzo dell'ibridazione in situ a fluorescenza immuno-RNA per visualizzare SARS-CoV-2

Prendi le cellule Vero fissate e permeabilizzate infettate da coronavirus, una linea cellulare di mammifero carente di interferone.

All'interno dell'ospite, l'RNA virale è presente come subgenomico o sgRNA, molecole di RNA di lunghezza intermedia che codificano per specifiche proteine virali sintetizzate tramite trascrizione.

Aggiungere le sonde di reazione a catena di ibridazione o iniziatore HCR.

La sonda HCR si lega alla sua sequenza complementare sull'RNA bersaglio.

Introdurre sonde a forcina oligonucleotidiche marcate in fluorescenza, H-1 e H-2.

La sonda iniziatrice si lega alla sua coda H1 complementare, linearizzando la struttura a forcina.

La sequenza H1 esposta si lega alla sua coda complementare H2.

La sequenza finale di H2 continua a legarsi a una coda H1, amplificando le sonde con tag fluorescenti intorno all'area bersaglio e generando un segnale robusto.

Aggiungere gli anticorpi appropriati per visualizzare il citoscheletro della cellula ospite.

Colora i nuclei usando DAPI.

Al microscopio a fluorescenza, le cellule infettate da virus mostrano una fluorescenza rossa nel citoplasma, indicando la presenza dell'RNA bersaglio.

Dopo aver fissato e permeabilizzato le cellule, come descritto nel manoscritto del testo, rimuovere la soluzione 1x PBS dai pozzetti e aggiungere almeno 300 microlitri di tampone di amplificazione a ciascun pozzetto. Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Preparare ogni forcina HCR raffreddando a scatto il volume desiderato in provette separate.

Per preparare 300 microlitri di soluzione di amplificazione, utilizzare 18 picamoli di ciascuna forcina. Trasferire la soluzione a forcina in provette e incubarle a 95 gradi Celsius per 90 secondi. Quindi, raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Preparare una miscela di forcine aggiungendo le forcine H1 e H2 raffreddate a scatto al tampone di amplificazione. Posizionare gocce da 30 a 50 microlitri di miscela di forcine sul parafilm e incubare i campioni per una notte al buio a temperatura ambiente.

Per montare i vetrini, posizionare due gocce da 10 microlitri di terreno di montaggio su un vetrino, assicurandosi che le gocce siano sufficientemente separate da consentire il posizionamento di due vetrini coprioggetti su un singolo vetrino. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando i vetrini coprioggetti su un asciugamano pulito. Quindi, posizionarli in un mezzo di montaggio anti-sbiadimento con le celle rivolte verso il basso. Posizionare i campioni montati su una superficie piana e asciutta al buio e lasciarli indurire.