Utilizzo dell'ibridazione in situ a fluorescenza immuno-RNA per visualizzare SARS-CoV-2
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Prendi le cellule Vero fissate e permeabilizzate infettate da coronavirus, una linea cellulare di mammifero carente di interferone.
All'interno dell'ospite, l'RNA virale è presente come subgenomico o sgRNA, molecole di RNA di lunghezza intermedia che codificano per specifiche proteine virali sintetizzate tramite trascrizione.
Aggiungere le sonde di reazione a catena di ibridazione o iniziatore HCR.
La sonda HCR si lega alla sua sequenza complementare sull'RNA bersaglio.
Introdurre sonde a forcina oligonucleotidiche marcate in fluorescenza, H-1 e H-2.
La sonda iniziatrice si lega alla sua coda H1 complementare, linearizzando la struttura a forcina.
La sequenza H1 esposta si lega alla sua coda complementare H2.
La sequenza finale di H2 continua a legarsi a una coda H1, amplificando le sonde con tag fluorescenti intorno all'area bersaglio e generando un segnale robusto.
Aggiungere gli anticorpi appropriati per visualizzare il citoscheletro della cellula ospite.
Colora i nuclei usando DAPI.
Al microscopio a fluorescenza, le cellule infettate da virus mostrano una fluorescenza rossa nel citoplasma, indicando la presenza dell'RNA bersaglio.
Dopo aver fissato e permeabilizzato le cellule,
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