Un test in vitro basato su cellule dendritiche pulsate con vaccino per indurre la proliferazione dei linfociti

Inizia aggiungendo gli antigeni del vaccino di prova alla coltura di cellule dendritiche.

La cellula dendritica riconosce l'antigene, lo internalizza tramite endocitosi mediata dal recettore, lo frammenta in peptidi più piccoli e trasferisce il complesso antigene-MHC risultante sulla superficie cellulare per la presentazione.

Co-coltura di cellule dendritiche presentanti l'antigene con linfociti T naive per consentire l'interazione tra il recettore delle cellule T e il complesso antigene-MHC, insieme ai loro co-recettori.

Questo porta alla formazione di sinapsi immunologiche, attivando i linfociti T tramite segnalazione intracellulare.

I linfociti T attivati subiscono un'espansione clonale, generando linfociti T effettori.

Aggiungere molecole di citochine di interleuchina-2, o IL-2, alla coltura e incubare. Il legame di IL-2 innesca la segnalazione intracellulare, consentendo la proliferazione e la sopravvivenza dei linfociti.

Prelevare un piccolo volume di coltura e centrifugare. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con cellule dendritiche presentanti l'antigene e trasferirlo nello stesso pozzetto.

La restimolazione con l'antigene aumenta la proliferazione dei linfociti.

Eseguire analisi a valle per quantificare marcatori specifici associati alla proliferazione dei linfociti.

Per generare MoDC pulsati con antigene, aggiungere 1 microlitro per millilitro di vaccino contro il virus della rabbia o sospensione RV a 1 millilitro di coltura MoDC naive nella piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per 48 ore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Il settimo giorno, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati con antigene sul ghiaccio per 10 minuti prima di aggiungere 1 millilitro di PBS ghiacciato per pozzetto e mescolarlo accuratamente. Trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri.

Lavare i pozzetti con 2 millilitri di PBS ghiacciato. Raccogliere le cellule residue all'interno di ciascun pozzetto e trasferire il contenuto lavato nelle rispettive provette. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 g per 7 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet di cellule MoDCs pulsato con antigene in un terreno di coltura completo per regolare la concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro.

Per la co-coltura dei linfociti MoDC, seminare i pozzetti di una piastra sterile a 24 pozzetti con 1 millilitro di sospensione di cellule linfocitarie naive e 1 millilitro di sospensione di MoDC pulsata con antigene o non pulsata con antigene il settimo giorno dell'impulso antigenico. Dopo due giorni di incubazione, integrare ogni pozzetto con 20 nanogrammi per millilitro di interleuchina-2 ricombinante e continuare l'incubazione per altre 120 ore.

Il giorno 14, trasferire 1 millilitro di co-coltura in una provetta sterile da 1,5 millilitri e centrifugare la provetta. Quindi, risospendere il pellet cellulare con 1 millilitro di MoDC pulsati o non pulsati con antigene. Mescolare bene e trasferire le sospensioni cellulari nei pozzetti corrispondenti.

Dopo la colorazione della superficie cellulare delle PBMC e dei linfociti e monociti naïve, trasferire 1 millilitro di sospensione cellulare in una provetta sterile da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 g. Quindi, risospendere il pellet in 1 millilitro di PBS e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri. Inoltre, raccogliere le cellule residue e le provette corrispondenti utilizzando 1 millilitro di PBS. Quindi, aggiungere 10 millilitri di PBS alla provetta da 15 millilitri contenente le cellule e mescolare mediante pipettaggio.

Dopo aver centrifugato la provetta per 7 minuti a 850 g, rimuovere il surnatante e risospendere con cura il pellet cellulare con la sospensione residua rimasta dopo la decantazione del surnatante. Trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.

Una volta completata la colorazione, eseguire l'analisi del citometro a flusso. Dall'anteprima in tempo reale, regola la soglia di fluorescenza, inclusi il voltaggio, il guadagno e le dimensioni delle celle per disegnare eventualmente i gate attorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari.