Un saggio di rilascio di colorante per quantificare l'attività enzimatica delle proteine antimicrobiche

Iniziare con un tubo contenente una sospensione batterica uccisa dal calore e trattare con una soluzione colorante.

Le molecole del colorante si legano in modo covalente al peptidoglicano, un componente essenziale della parete cellulare batterica, conferendo una colorazione blu.

Pellettare i batteri e rimuovere il surnatante contenente molecole di colorante non legate.

Risospendere i batteri e introdurre una soluzione proteica antimicrobica nella provetta, innescando l'idrolisi enzimatica del peptidoglicano batterico, con conseguente degradazione della parete cellulare seguita da lisi cellulare.

Questo porta al rilascio delle molecole di colorante, conferendo la colorazione blu.

Aggiungere etanolo, un agente denaturante delle proteine, che inattiva le proteine antimicrobiche e termina la reazione enzimatica.

Centrifugare il contenuto per pellettare i frammenti cellulari e gli enzimi. Trasferire il surnatante contenente la molecola di colorante in una piastra a più pozzetti.

Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'assorbanza a 595 nanometri.

Confrontare l'assorbanza del campione trattato con l'enzima con quella del campione non trattato con l'enzima per quantificare l'attività