Un saggio di rilascio di colorante per quantificare l'attività enzimatica delle proteine antimicrobiche

Iniziare con un tubo contenente una sospensione batterica uccisa dal calore e trattare con una soluzione colorante.

Le molecole del colorante si legano in modo covalente al peptidoglicano, un componente essenziale della parete cellulare batterica, conferendo una colorazione blu.

Pellettare i batteri e rimuovere il surnatante contenente molecole di colorante non legate.

Risospendere i batteri e introdurre una soluzione proteica antimicrobica nella provetta, innescando l'idrolisi enzimatica del peptidoglicano batterico, con conseguente degradazione della parete cellulare seguita da lisi cellulare.

Questo porta al rilascio delle molecole di colorante, conferendo la colorazione blu.

Aggiungere etanolo, un agente denaturante delle proteine, che inattiva le proteine antimicrobiche e termina la reazione enzimatica.

Centrifugare il contenuto per pellettare i frammenti cellulari e gli enzimi. Trasferire il surnatante contenente la molecola di colorante in una piastra a più pozzetti.

Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'assorbanza a 595 nanometri.

Confrontare l'assorbanza del campione trattato con l'enzima con quella del campione non trattato con l'enzima per quantificare l'attività enzimatica della proteina antimicrobica.

Nel saggio di rilascio del colorante, il substrato è legato in modo covalente al colorante Remazol Brilliant Blue R o RBB. Inizia questo protocollo creando una soluzione di RBB da 200 millimolari. Sciogliere 1,25 grammi di RBB in una soluzione di idrossido di sodio appena preparata.

Successivamente, risospendere le cellule batteriche uccise dal calore a una concentrazione di 0,5 grammi di peso umido in 30 millilitri di soluzione di RBB. Per il peptidoglicano purificato, risospendere il peptidoglicano a una concentrazione di 0,3 grammi di peso umido e 30 millilitri di soluzione di RBB.

Poiché i passaggi successivi sono gli stessi indipendentemente dal substrato utilizzato, la marcatura sarà dimostrata solo per le cellule batteriche. Incubare la miscela di reazione su una piattaforma rotante per sei ore a 37 gradi Celsius mescolando delicatamente. Dopo sei ore, trasferire la miscela di reazione in un incubatore a 4 gradi Celsius e incubare per altre 12 ore mescolando delicatamente.

Al termine dell'incubazione, raccogliere il substrato colorato mediante centrifugazione a 3.000 volte g per 30 minuti. Decantare la soluzione colorante dal pellet di substrato. Risospendere accuratamente il pellet in acqua di tipo 1 seguita da centrifugazione. Lavare le celle marcate con il colorante da tre a cinque volte in questo modo per rimuovere il colorante solubile legato in modo non covalente dai substrati.

Per i lavaggi finali, trasferire la parte del pellet che verrà utilizzata nel test di rilascio del colorante in provette per microfuge da 1,5 millilitri. Il surnatante dell'ultimo lavaggio deve essere limpido, mentre il substrato rimane blu. Conservare il substrato tinto sospeso in una quantità minima di acqua a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Per prepararsi al test di rilascio del colorante, lasciare che il substrato colorato congelato torni a temperatura ambiente e lavare due volte con il tampone di analisi che è stato determinato empiricamente per l'enzima. In questo caso viene utilizzato PBS. Calcolare il volume della sospensione del substrato necessario moltiplicando il volume di reazione di 200 microlitri per il numero di saggi di rilascio del colorante da eseguire.

Per preparare la sospensione del substrato, aggiungere prima il substrato colorato al volume appropriato di PBS. Effettuare una diluizione uno a uno ed effettuare una misurazione iniziale della densità ottica a 595 nanometri utilizzando PBS come bianco. Aggiungere quantità incrementali del substrato colorato alla sospensione fino a raggiungere una densità ottica di 2,0 a 595 nanometri.

In questa dimostrazione, il saggio di rilascio del colorante verrà utilizzato per determinare le condizioni di incubazione ottimali per una proteina antimicrobica. Innanzitutto, preparare una sospensione antimicrobica proteica standard regolando la concentrazione a 1 milligrammo per millilitro utilizzando PBS, come descritto nel testo del protocollo. Quindi, diluire la sospensione antimicrobica proteica stock a una concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro.

Questa concentrazione fornisce una massa di reazione finale di 1 microgrammo di proteine per volume aggiunto alla reazione del saggio. Eseguire i saggi di reazione in provette microfughe da 0,5 millilitri per l'intervallo termico da valutare. Per ogni condizione termica, aggiungere 10 microlitri di proteina madre a 200 microlitri di sospensione di substrato preparata.

Incubare in termociclatore per otto ore mescolando per inversione una volta all'ora. Dopo l'incubazione, arrestare le reazioni aggiungendo 25 microlitri di etanolo a ciascuna provetta per microfuge. Per rimuovere il substrato insolubile non digerito, centrifugare a 3.000 volte g per due minuti. Dopodiché, facendo attenzione a non rompere il pellet di substrato non digerito, trasferire 150 microlitri del surnatante di reazione per ogni miscela di reazione in una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti.

Per quantificare l'attività enzimatica, utilizzare uno spettrofotometro per micropiastre per misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nanometri. L'aumento dell'assorbanza da parte del colorante solubile rilasciato nel surnatante dal substrato marcato è una misura quantitativa dell'attività enzimatica.